[發明專利]一種紅耳龜胚胎成纖維細胞系及其構建方法

有效

• 申請號: 201711092592.4
• 申請日: 2017-11-08
• 公開（公告）號: CN107858323B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 曹代男;段好冉;魏玉峰;楊江波;萬小娟;葛研;龔世平
• 申請（專利權）人: 廣東省生物資源應用研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N15/85;C12N15/65
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;胡素麗

本發明公開了一種紅耳龜胚胎成纖維細胞系及其構建方法。它是取孵化至第12～18d的紅耳龜卵，挑選活胚后對紅耳龜卵進行消毒，去殼取紅耳龜胚，棄頭、四肢及內臟，余下的胚胎組織用含雙抗的PBS沖洗至無明顯血跡；將沖洗至無明顯血跡的胚胎組織用胰蛋白酶消化，收集消化下來的單細胞，將單細胞接種于完全培養基中靜置培養，當細胞部分貼壁且稍加振蕩也不浮起時，吸去完全培養基和尚未貼壁的細胞，剩下的貼壁細胞加入新的完全培養基后繼續培養；當原代培養的細胞匯合度達到90％以上時，用胰蛋白酶消化，收集單細胞，再接種于完全培養基中進行傳代培養。本發明為進一步利用RSTEFs進行基礎理論和實驗研究奠定了材料和技術基礎。

技術領域：

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種紅耳龜胚胎成纖維細胞系及其構建方法。

背景技術：

紅耳龜(Trachemys scripta elegans)又名巴西龜，原產于美國中部至墨西哥北部，由于國際貿易的原因，該種已被引入歐洲、非洲、澳洲、亞洲以及美洲等許多國家，成為世界性的危險入侵物種。同時紅耳龜價格低廉、數量多，也是動物學、生理學、醫學等研究的實驗動物。研究表明，紅耳龜對溫度變化、饑餓、高鹽脅迫和酸脅迫具有較強的耐受性，然而目前這些研究主要涉及生理生化表型性狀層面，尚未深入至細胞學和分子機制，其重要原因可能是紅耳龜細胞的體外培養技術不成熟，缺乏能夠用于實驗研究的相關細胞系。目前已報道的體外培養的龜類細胞僅有卡羅來納箱龜(Terrapene carolina)心臟細胞，西部錦龜(Chrysemys picta bellii)、蛇鱷龜(Chelydra serpentina)、美國鱉(Apalone mutica)的肝臟和脾臟細胞，綠海龜(Chelonia mydas)心臟、肝臟等13種細胞，紅海龜(Carettacaretta)、鷹嘴海龜(Eretmochelys imbricata)、多盾海龜(Lepidochelys olivacea)成纖維細胞和中華鱉心臟細胞等少數幾個品種。本專利旨在建立穩定的紅耳龜胚胎成纖維細胞(Red-eared slider turtle embryonic fibroblasts,RSTEFs)分離培養體系，為從細胞水平深入研究紅耳龜對逆境脅迫的耐受機制，以及相關生理學、醫學研究奠定材料和技術基礎。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一種紅耳龜胚胎成纖維細胞系及其構建方法，為從細胞水平深入研究紅耳龜對逆境脅迫的耐受機制，以及相關生理學、醫學研究奠定材料和技術基礎。

本發明的第一個目的是提供紅耳龜胚胎成纖維細胞系的構建方法，包括以下步驟：

a)胚胎的處理：取孵化至第12～18d的紅耳龜卵，挑選活胚后對紅耳龜卵進行消毒，去殼取紅耳龜胚，棄頭、四肢及內臟，余下的胚胎組織用含雙抗的PBS沖洗至無明顯血跡；

b)原代培養：將沖洗至無明顯血跡的胚胎組織用胰蛋白酶消化，收集消化下來的單細胞，將單細胞接種于完全培養基中靜置培養，當細胞部分貼壁且稍加振蕩也不浮起時，吸棄完全培養基和尚未貼壁的細胞，剩下的貼壁細胞加入新的完全培養基后繼續培養；

c)傳代培養：當原代培養的細胞匯合度達到90％以上時，用胰蛋白酶消化，收集單細胞，再接種于完全培養基中進行傳代培養。

所述的挑選活胚后對紅耳龜卵進行消毒具體為：將挑選有活胚的紅耳龜卵用體積分數6％新潔爾滅溶液浸泡3min。

所述的傳代培養的接種比例優選為1:2～3。或者，所述的傳代培養的接種密度優選為1.25～2.5×10⁴/cm²。

所述的原代培養和傳代培養的培養條件均優選為：飽和濕度，30～34℃，5％CO₂。進一步優選為：飽和濕度，34℃，5％CO₂。