[發明專利]一種紅耳龜胚胎成纖維細胞系及其構建方法

有效

• 申請號: 201711092592.4
• 申請日: 2017-11-08
• 公開（公告）號: CN107858323B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 曹代男;段好冉;魏玉峰;楊江波;萬小娟;葛研;龔世平
• 申請（專利權）人: 廣東省生物資源應用研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N15/85;C12N15/65
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;胡素麗

1.一種紅耳龜胚胎成纖維細胞系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)胚胎的處理：取孵化至第12～18d的紅耳龜卵，挑選活胚后對紅耳龜卵進行消毒，去殼取紅耳龜胚，棄頭、四肢及內臟，余下的胚胎組織用含雙抗的PBS沖洗至無明顯血跡；

b)原代培養：將沖洗至無明顯血跡的胚胎組織用胰蛋白酶消化，收集消化下來的單細胞，將單細胞接種于完全培養基中靜置培養，當細胞部分貼壁且稍加振蕩也不浮起時，吸棄完全培養基和尚未貼壁的細胞，剩下的貼壁細胞加入新的完全培養基后繼續培養；

c)傳代培養：當原代培養的細胞匯合度達到90％以上時，用胰蛋白酶消化，收集單細胞，再接種于完全培養基中進行傳代培養；

所述的傳代培養的接種密度為1.25～2.5×10⁴/cm²。

2.根據權利要求1所述的紅耳龜胚胎成纖維細胞系的構建方法，其特征在于，所述的挑選活胚后對紅耳龜卵進行消毒具體為：將挑選有活胚的紅耳龜卵用體積分數6％新潔爾滅溶液浸泡3min。

3.根據權利要求1所述的紅耳龜胚胎成纖維細胞系的構建方法，其特征在于，所述的傳代培養的接種比例為1:2～3。

4.根據權利要求1所述的紅耳龜胚胎成纖維細胞系的構建方法，其特征在于，所述的原代培養和傳代培養的培養條件均為：飽和濕度，30～34℃，5％CO₂。

5.根據權利要求4所述的紅耳龜胚胎成纖維細胞系的構建方法，其特征在于，所述的原代培養和傳代培養的培養條件均為：飽和濕度，34℃，5％CO₂。

6.根據權利要求1所述的紅耳龜胚胎成纖維細胞系的構建方法，其特征在于，所述的將沖洗至無明顯血跡的胚胎組織用胰蛋白酶消化具體為：將沖洗至無明顯血跡的胚胎組織移入含有0.25％胰蛋白酶的容器中，用眼科剪反復剪成小塊，置37℃水浴鍋中消化20min，期間定期用移液槍反復吹打，消化后加入完全培養基終止消化。

7.根據權利要求1所述的紅耳龜胚胎成纖維細胞系的構建方法，其特征在于，所述的含雙抗的PBS為含0.5kU/mL青霉素和0.5mg/mL鏈霉素的PBS。

8.權利要求1～7任一項所述的紅耳龜胚胎成纖維細胞系的構建方法構建得到的紅耳龜胚胎成纖維細胞系。

9.權利要求8所述的紅耳龜胚胎成纖維細胞系在細胞轉染中的應用。