[發明專利]一種基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法

有效

• 申請號: 201711092555.3
• 申請日: 2017-11-08
• 公開（公告）號: CN107893109B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 浦丹;趙珊;舒坤賢
• 申請（專利權）人: 重慶郵電大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 重慶輝騰律師事務所 50215
• 代理人: 寸南華

本發明公開了一種基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法，本發明方法在PCR擴增前對用作DNA模板的樣品DNA進行處理，使3'末端被封閉的含突變位點的核苷酸單鏈作為雜交鏈與野生型和突變型序列雜交，雙鏈特異性核酸酶能特異性地移除雜交鏈與野生型序列形成的完全互補配對的同源雙鏈DNA，但不能移除雜交鏈與突變型序列形成的非完全互補的異源雙鏈DNA。移除后的產物經PCR擴增，PCR擴增所用的一條引物3'末端位于突變位點上且被封閉，在具有3'?5'校讀活性的聚合酶作用下，使野生型序列不能擴增，但突變型序列得以指數擴增，由此有效富集低豐度基因突變序列，提高了富集靈敏度和準確度，同時本發明方法還可以同時富集多種突變型序列從而提高擴增效率。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法。

背景技術

人類基因組計劃的完成推動了基因突變研究的快速發展。近年來，“精準醫療”計劃的提出更進一步使基因突變及其檢測方法研究成為生物學研究和臨床精準醫療的熱點和基礎。隨著檢測技術的不斷發展，研究人員發現大多數基因突變表現為低豐度(含量從0～100％)，并且這些低豐度基因突變在醫學和生物學等領域具有重要的研究意義。不斷出現的新方法和技術為低豐度基因突變的富集提供了可靠的前景，這些技術大部分基于PCR技術原理。PCR即聚合酶鏈式反應，是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，能將微量的DNA大幅增加。PCR反應體系主要包括五種試劑即引物、DNA聚合酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg²⁺)，PCR反應步驟主要包括預變性、變性、退火和延伸，其中變性、退火和延伸3步的循環運行為核心步驟。變性即通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；退火即當溫度突然降低時，由于模板分子結構較引物要復雜得多，而且反應體系中引物DNA量大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少；延伸即在DNA聚合酶和4種dNTP底物及Mg²⁺存在的條件下，5'→3'的DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應，變性、退火和延伸3步為一個循環，每一循環的產物可以作為下一個循環的模板，數小時之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復制，數量可達2×10^6～7拷貝。目前，已經報道了在PCR擴增之前、之中或之后減少野生型序列的方法，但是這些方法通常適用于單個PCR擴增子，或僅適用于序列特異性酶能識別的少數DNA靶標。另外，PCR擴增過程可能引入由堿基錯配導致的假陽性，導致基因突變很難和假陽性信息區分開來。近年來，隨著高通量技術的出現，移除樣本中大量野生型DNA序列的需求日益增加，例如高通量測序文庫制備之前移除大量野生型DNA。通常高通量測序無法檢測豐度低于～2％的DNA突變，采用移除大量野生型DNA序列的方法能有效富集低豐度突變型序列以期提高測序檢測限。本發明提供一種基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法，該方法能同時擴增多個PCR擴增子，而且野生型序列移除是在PCR擴增反應前進行的，它能有效避免PCR擴增過程堿基錯配導致的假陽性，而且本發明中PCR擴增過程通過引入一條引物3'末端位于突變位點上且被封閉，在具有3'-5'校讀活性的聚合酶作用下，野生型序列與該引物完全互補而不能繼續延伸，而突變型序列由于最后一個錯配使錯配堿基被切除而繼續延伸，使突變型序列進一步得以富集。該方法簡單、準確度高，可應用于醫學和生物學的許多領域，以推動個體化醫療的發展。

發明內容

鑒于此，本發明提供一種基于移除野生型序列的低豐度基因突變的富集方法，操作簡單且準確性更好的富集方法，能同時擴增多個PCR擴增子，且有效避免PCR擴增低豐度突變基因過程中的假陽性問題。

本發明采用的技術方案是：