[發(fā)明專利]一種基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711092555.3
• 申請(qǐng)日: 2017-11-08
• 公開（公告）號(hào): CN107893109B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 浦丹;趙珊;舒坤賢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶郵電大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 重慶輝騰律師事務(wù)所 50215
• 代理人: 寸南華

1.一種基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法，其特征在于，包括樣品DNA提取、樣本處理、PCR擴(kuò)增和結(jié)果分析，

所述樣本處理的步驟包括雜交和消化；

所述雜交為首先將提取的樣品DNA與雜交鏈混合得到雜交混合物，所述雜交鏈為3'末端被封閉的核苷酸單鏈，所述3'末端被封閉的核苷酸單鏈的序列根據(jù)野生型序列設(shè)計(jì)和合成且包含突變位點(diǎn)，所述突變位點(diǎn)為所述野生型序列與所述野生型序列的突變型序列相比對(duì)堿基不一致的位置，然后將所述雜交混合物于高溫變性使所述樣品DNA從雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA，最后降溫使所述雜交鏈與所述單鏈DNA中的所述野生型序列形成完全互補(bǔ)配對(duì)的同源雙鏈DNA和與所述單鏈DNA中的所述突變型序列形成突變位點(diǎn)堿基錯(cuò)配的非完全互補(bǔ)配對(duì)的異源雙鏈DNA；

所述消化為在所述雜交得到的產(chǎn)物中加入雙鏈特異性核酸酶使所述同源雙鏈DNA降解，然后升溫使所述雙鏈特異性核酸酶失活，所述雙鏈特異性核酸酶為能夠特異性地降解雙鏈DNA和DNA-RNA雜交體中的DNA的熱穩(wěn)定核酸酶；

所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中的DNA模板為所述消化得到的產(chǎn)物；

所述反應(yīng)體系中的DNA聚合酶為具有3'端到5'端核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶，所述反應(yīng)體系中的引物根據(jù)野生型序列設(shè)計(jì)和合成，所述引物中的正向引物或反向引物的3'末端被封閉且3'末端堿基在所述突變位點(diǎn)上。

2.如權(quán)利要求1所述的基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法，其特征在于，所述3'末端被封閉的核苷酸單鏈為多種不同的核苷酸序列，所述不同的核苷酸序列包含不同的突變位點(diǎn)，所述引物的對(duì)數(shù)與所述核苷酸序列的種數(shù)相同且每一對(duì)引物對(duì)應(yīng)擴(kuò)增一個(gè)含突變位點(diǎn)的片段。

3.如權(quán)利要求1或2所述的基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法，其特征在于，所述3'末端被封閉的方法為3'末端的核苷酸被去磷酸化、被氨基化或被巰基化。

4.如權(quán)利要求1或2所述的基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法，其特征在于，所述引物擴(kuò)增的序列的長(zhǎng)度在200 bp以內(nèi)。

5.如權(quán)利要求1或2所述的基于移除野生型序列的低豐度基因突變富集方法，其特征在于，所述結(jié)果分析的方法為焦磷酸測(cè)序、Sanger測(cè)序或高分辨溶解曲線。