[發明專利]采用化學發光法定量檢測赭曲霉毒素的試劑盒

在審

• 申請號: 201711090268.9
• 申請日: 2017-11-08
• 公開（公告）號: CN107884581A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 王愛萍;周景明;張改平;趙軍;劉紅亮;祁艷華;胡小宏;劉燕凱;李春革;牛艷;孫國蘋
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535;G01N33/577;G01N21/76
• 代理公司: 鄭州異開專利事務所(普通合伙)41114
• 代理人: 韓華

技術領域

本發明涉及生物檢測技術，尤其是涉及一種采用化學發光法定量檢測赭曲霉毒素的試劑盒。

背景技術

赭曲霉毒素是由真菌如曲霉菌和青霉菌分泌的有毒代謝物，是400多種具有不同化學結構和毒性作用的真菌毒素的主要組成部分。赭曲霉毒素廣泛存在于各種食物中，如谷物及其副產品、可可、咖啡、肉類、乳汁、干果、調味品、酒類等，對人類及動物健康造成了很大的威脅。OTA具有腎毒性，免疫毒性和致畸作用，并被國際癌癥研究機構（IARC）歸類為目前致癌力最強的天然物質之一，并且分布范圍很廣。最有害的赭曲霉毒素A（OTA）可以在死亡的宿主真菌內存活，并在人體中有長達35天的半衰期。OTA的有害影響與其結構有關，帶有7-羧基基團的苯丙氨酸的酰胺鍵；OTA似乎與天然苯丙氨酸在蛋白質合成中有競爭關系，影響在蛋白質合成和細胞凋亡中酶的抑制和激活，影響免疫抑制、免疫器官的減少和抗體反應抑制，改變免疫細胞活性和調節細胞因子的生成。

OTA作為一種小分子半抗原，不具有免疫原性，因此OTA只能與大分子載體蛋白偶聯后才能誘導動物產生免疫應答，再利用單克隆抗體技術獲得既能無限增殖又能分泌抗OTA單抗的雜交瘤細胞株，最后通過體內誘生腹水的方法獲得大量的抗OTA單克隆抗體。通過篩選反應性最強，靈敏度高和特異性好的抗體配對，建立反應體系，確定適合用于包被的單克隆抗體以及適合用于標記的單克隆抗體。針對包被抗體，建立反應性最高、37℃存放14天后仍能夠保持反應性保持穩定的微孔板包被方法及保護蛋白種類，確定OTA單克隆抗體與固相載體能夠緊密的連接在一起，使兩者經過長時間的高溫破壞也能保持穩定。

目前，檢測OTA的方法需要有儀器分析和免疫分析。儀器分析包括高效液相色譜（HPLC），液相色譜串聯質譜（LC-MS / MS），盡管許多實際樣品中具有極高的敏感性和多功能性，但這些檢測方法需要樣品前期處理的時間長，同時設備昂貴，操作復雜。免疫測定，如酶聯免疫吸附測定（ELISA）雖可在較短的時間內完成樣品分析，但該方法靈敏度差，檢測限偏高，檢測結果不精確。

發明內容

本發明的目的在于提供一種采用化學發光法定量檢測赭曲霉毒素的試劑盒，以解決現有檢測需要的試劑種類多，檢測操作繁瑣且檢測靈敏度低的問題。

為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案：

本發明所述的采用化學發光法定量檢測赭曲霉毒素的試劑盒，是由空白發光板、包被抗體、酶標抗體、赭曲霉毒素A標準、發光底物、洗滌液組成；所述酶標抗體采用只與OTA特異性結合的單克隆抗體，其亞型為重鏈IgG1，輕鏈Kappa型，親和力達2.11×10¹¹ L/mol。

所述酶標抗體采用的單克隆抗體是將篩選出的陽性單抗用辛酸-硫酸銨法純化后，通過簡易過碘酸鈉法偶聯得到。

所述包被抗體的制備方法為：將合成的OTA-BSA分別加入弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑用乳化劑乳化，通過背部皮下多點注射的方法，免疫8周齡的雌性BALB/c小鼠，50μg/只；間隔2周免疫一次，共免疫四次，取效價高的小鼠的脾臟與瘤細胞進行細胞融合，篩選陽性克隆，再通過體內誘生腹水的方法大量制備抗OTA單克隆抗體，最后純化得到。

所述赭曲霉毒素A標準從OTA的純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇:水=7:3，共7瓶，其OTA的濃度分別為0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL、32ng/mL、64ng/mL。

所述發光底物的制備方法為：以0.1mol/l過氧化脲為氧化劑，和緩沖液磷酸氫二鈉-檸檬酸配制發光底物A；以0.05mol/l魯米諾為發光劑，和緩沖液Tris-HCL配制成發光底物B。

本發明采用0.05M pH9.6的CBS緩沖液作為包被緩沖液，5%脫脂奶+0.05M pH7.4的PBST作為封閉液，0.05M pH7.5 Tris-HCL緩沖液作為酶稀緩沖液。

所述洗滌液采用PBS+0.1-0.5%Tween-20。

采用本發明試劑盒檢測赭曲霉毒素A時，首先處理標本：

谷物樣品處理方法為：將谷物樣品粉碎至20目，稱取粉末5g至試管中，加入提取液10ml，提取液為甲醇:水體積比=4:1，加塞后再旋渦混勻器上劇烈震蕩混勻10min，以5000r/min的速度離心5min，棄去沉淀，保留上清并用PBS將其稀釋成適宜的倍數以便進行檢測。

血液樣品的處理方法：取0.5ml血液加0.5ml的甲醇水溶液，甲醇：水=4:1，備用。