[發明專利]一種阿魏酸酯酶基因、基因工程菌株以及制備方法和用途

有效

• 申請號: 201711086961.9
• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN108048473B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 呂紅;劉洋;周峻崗;余垚
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/18;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/645
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明提供了一種阿魏酸酯酶基因，其來源于中國牦牛瘤胃微生物，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，編碼如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本發明還提供了含有該基因的馬克斯克魯維酵母重組表達載體及基因工程菌株，并提供了制備阿魏酸酯酶的方法和制得的阿魏酸酯酶的用途。將阿魏酸酯酶在馬克斯克魯維酵母表達系統中重組表達，經高密度發酵48小時后胞內和胞外的阿魏酸酯酶的活力分別為686.35U/mL和346.34U/mL。馬克斯克魯維酵母重組表達的阿魏酸酯酶可釋放玉米麩皮中的阿魏酸。利用本發明獲得的阿魏酸酯酶，可用于食品加工、飼料添加、生物醫藥、纖維素物質生物轉化、生物能源等領域。

技術領域

本發明屬生物工程領域，具體涉及一種阿魏酸酯酶基因、含有該基因的馬克斯克魯維酵母重組表達載體和基因工程菌株以及阿魏酸酯酶的制備方法和用途。

背景技術

阿魏酸(ferulic acid)的化學名稱為3-甲氧基-4-羥基肉桂酸，廣泛存在于植物細胞壁的木質素與木質素之間、木質素與半纖維素之間形成交接。阿魏酸是天然抗氧化劑，能清除體內的過氧化氫、超氧自由基、羥自由基、過氧化亞硝基，能調節生理機能、抑制產生自由基的酶、增加清除自由基酶的活性，具有抗菌消炎以及抗突變和防癌作用。阿魏酸廣泛存在于食品原料中，麥麩中的阿魏酸是桂皮酸的衍生物之一，有順式和反式2種構象，反式阿魏酸在美國、日本已被允許用作食品添加劑，在醫藥、食品和化妝品工業中也被廣泛應用。阿魏酸的生產方法有化學合成法、堿法和酶法，近年來酶解法制備阿魏酸受到廣泛關注。目前已有文獻報道利用阿魏酸酯酶從麥麩、玉米麩皮、啤酒糟、谷物纖維、甜菜渣、燕麥殼和蘋果渣等原材料中提取阿魏酸(張璟等，食品科學，2003，24：63-68；薛楓等，糧食與飼料工業，2006：17-19)。

阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73，Feruloyl esterase，FAE)又稱肉桂酸酯酶，屬于水解酶類的羧酸酯水解酶亞類，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放出游離阿魏酸。阿魏酸酯酶廣泛存在于谷物中，由細菌或真菌產生，是一類胞外酶，1991年首次由Faulds等(Faulds et al，Microbiology,1991,137:2339-2345)從橄欖色鏈霉菌(Streptomyces olivochromogenes)中分離出來，目前已有超過30種阿魏酸酯酶被純化。不同來源的阿魏酸酯酶具有不同的酶學特性，根據其底物的專一性、氨基酸序列的同源性以及水解時釋放二聚阿魏酸的能力，主要將阿魏酸酯酶分為A、B、C和D四大類型(Crepinet al，Appl Microbiol Biotechnol,2004,63:647-652)。目前對A型和B型阿魏酸酯酶的研究最為普遍，其中，A型傾向于催化含間位甲氧基或較大疏水取代基團的酚類衍生物，B型更傾向于催化含有一至二個羥基的酚類衍生物。

阿魏酸酯酶是降解植物細胞壁木質化纖維素的重要酶類之一，半纖維素是一種阿拉伯糖基木聚糖，其中阿魏酸、二聚阿魏酸、香豆酸等酚酸類木質素通過酯鍵連接到阿拉伯糖上可增強阿拉伯木聚糖鏈的強度，因而限制了動物和微生物對植物細胞壁中的纖維素、半纖維素的有效降解。阿魏酸酯酶可以打斷阿魏酸與細胞壁多糖的連接，高效降解多糖并獲得低聚糖及阿魏酸。

在造紙工業中的應用，利用阿魏酸酯酶、木聚糖酶及漆酶等的協同作用一起催化水解植物性原材料麥稈漿粕、油籽亞麻漿粕等，將阿魏酸從植物細胞壁的結構中游離出來，從而斷開木質素、半纖維素以及纖維素之間的連接，結構變得疏松，并且能夠提高紙漿的白度，減少脫除木質素漂白氯的使用量。

在飼料中添加阿魏酸酯酶能促進飼料中半纖維素的消化，降低了腸道中食糜的粘度，加速了排空速度和營養物質的吸收利用。Selinger等(Selinger et al.Anaerobe,1996,2:263-284)研究發現阿魏酸酯酶等作為飼料的添加劑，既能加快植物細胞壁等成分在瘤胃中的降解速度，也能提高反芻家畜對飼料的消化程度，減少隨糞便排出的營養物質，從而提高飼料的利用效率。