[發(fā)明專(zhuān)利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的針刺生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化小麥方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711084783.6
• 申請(qǐng)日: 2017-11-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108165572A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王翔;尹鈞;尹飛;李磊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/82
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

本發(fā)明公開(kāi)了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的針刺生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化小麥方法，步驟包括：⑴將小麥種子培養(yǎng)至胚芽鞘長(zhǎng)0.5?1cm；⑵將含有目的基因的農(nóng)桿菌用YEB培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)；⑶用注射器針頭蘸取準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌針刺莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的位置；⑷將針刺后的小麥外植體在25℃黑暗培養(yǎng)2天；⑸然后將小麥農(nóng)桿菌侵染后的外植體轉(zhuǎn)入蛭石營(yíng)養(yǎng)土中，在溫室中培養(yǎng)。用本發(fā)明的方法可以快速獲得轉(zhuǎn)基因小麥株系，可以培育出各種抗逆的小麥新種質(zhì)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域中一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法及應(yīng)用，涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的、針刺幼芽生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化小麥的方法。

背景技術(shù)

小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一，全世界40％的人口以小麥為主食。2015年全球小麥的種植規(guī)模為2.24億公頃，總產(chǎn)量為6.9億噸。在我國(guó)北方，小麥?zhǔn)欠N植面積最大的糧食作物。各種生物逆境和非生物逆境是影響我國(guó)小麥的生產(chǎn)面臨的重要威脅。小麥遺傳轉(zhuǎn)化困難等問(wèn)題嚴(yán)重影響小麥功能基因組學(xué)的進(jìn)展和研究。這些難題的解決有賴于小麥基因工程的進(jìn)程。

由于小麥的基因組巨大，遺傳背景復(fù)雜，遺傳轉(zhuǎn)化困難，是三個(gè)重要的禾本科作物中最后一個(gè)獲得轉(zhuǎn)基因成功的。盡管從1992年以來(lái)利用基因槍法、花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、PEG法、電激法和激光微束法分別獲得了轉(zhuǎn)基因小麥，但其轉(zhuǎn)化率都比較低。由于基因槍等物理轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)基因小麥存在外源基因的拷貝數(shù)多、再生困難和不育等缺陷，使小麥基因轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為限制小麥基因工程研究發(fā)展的重要因素。由于這種限制，至今獲得的有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因小麥極其有限。與其他轉(zhuǎn)化方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化具有操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)周期較短等特點(diǎn)，更重要的是外源基因插入的拷貝性和完整性以及轉(zhuǎn)基因植株可育植株比例高等優(yōu)點(diǎn)。因此研究一套農(nóng)桿菌介導(dǎo)的快速、高效小麥轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以突破小麥基因工程瓶頸具有重要的理論意義和巨大的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥針刺莖尖轉(zhuǎn)化方法，本方法不僅容易操作、費(fèi)用低、高效率，能夠顯著提高植株的存活率，減少了外植體感染農(nóng)桿菌污染的幾率，而且不需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的組織培養(yǎng)、能夠得到大量的陽(yáng)性后代等特點(diǎn)，具有很高的實(shí)際操作性及應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：

一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的針刺生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化小麥的轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：

⑴將消毒后的小麥種子在濕潤(rùn)的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至胚芽鞘長(zhǎng)0.5-1cm；

⑵將含有目的基因的農(nóng)桿菌用YEB培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600濃度為0.5時(shí)，加入200μM乙酰丁香酮，培養(yǎng)至OD600濃度為0.6時(shí)備用；

⑶用注射器針頭蘸取準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌針刺莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的位置；

⑷將針刺后的小麥外植體在25℃黑暗培養(yǎng)2天；

⑸然后將小麥農(nóng)桿菌侵染后的外植體轉(zhuǎn)入蛭石營(yíng)養(yǎng)土中，在溫室中培養(yǎng)。

而且，所述步驟⑴中小麥種子消毒的方法為：用95％酒精洗2min，然后用20％次氯酸鈉處理10min，無(wú)菌水沖洗3次。

而且，所述農(nóng)桿菌的YEB培養(yǎng)液配方為胰蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl2g/L，農(nóng)桿菌培養(yǎng)溫度為28℃。

而且，所述含有目的基因的農(nóng)桿菌是含有插入表達(dá)載體后的重組質(zhì)粒，優(yōu)選農(nóng)桿菌菌株為EHA105、GV3101或AGL1。

而且，所述農(nóng)桿菌的表達(dá)載體為植物表達(dá)載體，優(yōu)選pCAMBIA系列載體。

而且，所述遺傳轉(zhuǎn)化的外植體為小麥種子萌發(fā)后時(shí)得到的莖尖，胚芽鞘大概0.5-1cm，0.8cm。

而且，步驟⑶所述的針刺生長(zhǎng)點(diǎn)的位置的操作為：與胚芽鞘生長(zhǎng)方向垂直，用5號(hào)注射器針頭刺入生長(zhǎng)點(diǎn)位置，操作前掰幾個(gè)胚芽判斷生長(zhǎng)點(diǎn)的準(zhǔn)確位置，大約1.5mm后迅速拔出。