[發明專利]一種農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥方法

在審

• 申請號: 201711084783.6
• 申請日: 2017-11-07
• 公開（公告）號: CN108165572A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發明（設計）人: 王翔;尹鈞;尹飛;李磊
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

1.一種農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥的轉基因方法，其特征在于：包括以下步驟：

⑴將消毒后的小麥種子在濕潤的培養皿中培養至胚芽鞘長0.5-1cm；

⑵將含有目的基因的農桿菌用YEB培養液振蕩培養，當菌液OD600濃度為0.5時，加入200μM乙酰丁香酮，培養至OD600濃度為0.6時備用；

⑶用注射器針頭蘸取準備好的農桿菌針刺莖尖生長點的位置；

⑷將針刺后的小麥外植體在25℃黑暗培養2天；

⑸然后將小麥農桿菌侵染后的外植體轉入蛭石營養土中，在溫室中培養。

2.根據權利要求1所述的農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥的轉基因方法，其特征在于：所述步驟⑴中小麥種子消毒的方法為：用95％酒精洗2min，然后用20％次氯酸鈉處理10min，無菌水沖洗3次。

3.根據權利要求1所述的農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥的轉基因方法，其特征在于：所述農桿菌的YEB培養液配方為胰蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl2g/L，農桿菌培養溫度為28℃。

4.根據權利要求1所述的農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥的轉基因方法，其特征在于：所述含有目的基因的農桿菌是含有插入表達載體后的重組質粒，優選農桿菌菌株為EHA105、GV3101或AGL1。

5.根據權利要求4所述的農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥的轉基因方法，其特征在于：所述農桿菌的表達載體為植物表達載體，優選pCAMBIA系列載體。

6.根據權利要求4所述的農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥的轉基因方法，其特征在于：所述遺傳轉化的外植體為小麥種子萌發后時得到的莖尖，胚芽鞘大概0.5-1cm，0.8cm。

7.根據權利要求4所述的農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥的轉基因方法，其特征在于：步驟⑶所述的針刺生長點的位置的操作為：與胚芽鞘生長方向垂直，用5號注射器針頭刺入生長點位置，操作前掰幾個胚芽判斷生長點的準確位置，大約1.5mm后迅速拔出。

8.根據權利要求4所述的農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥的轉基因方法，其特征在于：所述注射器針頭為5號針頭。

9.權利要求1-7中任一所述的農桿菌介導的針刺生長點轉化小麥的轉基因方法在植物基因功能驗證中的應用。

10.根據權利要求1-7任一權利要求所述的小麥轉基因方法，其特征在于：所述植物為栽培或野生小麥品種、品系、或育種材料。