[發明專利]紅球菌菌株YF28-1-4的誘變篩選方法及應用

在審

• 申請號: 201711083328.4
• 申請日: 2018-02-11
• 公開（公告）號: CN108251412A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 楊蕊琪;常思靜;張威;章高森;陳拓;劉光琇
• 申請（專利權）人: 中國科學院寒區旱區環境與工程研究所
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01;A62D3/02;C12R1/01;A62D101/20
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 王新生

本發明公開了一種紅球菌菌株YF28?1?4的誘變篩選方法及應用，首先通過重離子輻照對紅球菌(Rhodococcus erythropolis YF28?1(8))基因組進行初次誘變，篩選出降解效果好的菌株再次通過超強誘變劑NTG對其進行復誘變，得到紅球菌突變體庫，再通過原油平板和和GC?MS的篩選，得到轉錄系統和翻譯系統發生突變的菌株YF28?1?4；本發明提供的紅球菌(Rhodococcus erythropolis)菌株YF28?1?4具有高效的原油降解能力，同時，上述誘導篩選方法具有操作簡單，周期短，效率高的優點，不僅可適用于紅球菌，也適用于其他具有一定原油降解能力的微生物，具有很好的推廣使用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及原油高效降解菌誘變及快速獲取方法及其應用。

背景技術

原油及其副產品作為一種重要的能源物質和工業原料正在被世界各國的人們廣泛開采，其在社會經濟發展中具有非常廣泛的作用與功能。但由于有限的技術及淡薄的環保意識，使得環境中原油污染日益嚴重，破壞了正常的生態平衡。僅1996-1999年間在阿拉斯加每年大概都有407起原油泄漏事故；2010年大連新港原油泄漏事件，至少污染了附近50平方公里的海域，影響范圍達100平方公里。全世界每年約有800萬噸石油進入環境，如何安全有效地對石油污染的水和土壤環境進行修復，降低生態風險，已成國際焦點問題。

常用的原油污染修復手段有物理法、化學法及生物修復法。近年來，物理法和化學法因為成本高，操作復雜，對設備要求高，會產生二次污染等缺點，逐漸被生物修復法代替。生物修復法是利用微生物自身的代謝來分解污染物，其最終產物是CO2、H2O等物質，不會對環境產生二次污染，所以被認為是一種綠色的處理方法，而且利用菌株能降解一些用物理、化學方法不易降解的物質。

環境中主要參與烷烴降解的有細菌，真菌和酵母，目前研究發現降解活性最強，適用性最廣的是細菌。目前，現代分子生物學技術發展迅速，已在諸多工業微生物菌種改造方面獲得成功，但傳統的誘變育種技術仍是獲得優良菌株的重要手段。所以尋找一種新的高效的降解菌株的方法很有必要。

目前，研究表明原油降解基因的表達由多種轉錄調控因子調控。在Pseudomonasputida GPo1菌株中，在alkB基因上游的alkS基因是烷烴誘導的轉錄激活因子，烷烴的出現能夠誘導alkB表達量升高。與以丙酮酸鹽為碳源生長相比，Alcanivorax borkumensis SK2細胞以十六烷為碳源生長時，alkS基因的表達量顯著提高。除了alkS基因外，還有其他調控因子參與原油降解基因的表達調控。在Alcanivorax borkumensis菌株中，alkS基因負責調控alkB1但與alkB2的表達量沒有相關性，alkB2可能受其上游相鄰基因GntR調控因子的調控。在A. borkumensis菌株中還有編碼細胞色素P450的三個基因，AraC位于P450-1基因的上游，可能調控該氧化酶的表達。因此，從這個角度來講，如果通過某些方法使微生物轉錄、翻譯這些基因，這將是獲得高效降解菌株的一種有效辦法。

重離子輻照技術是80年代興起的一種材料表面處理技術，由我國科學工作者余增亮首創，將重離子輻照技術應用于農作物品種改良并獲得成功。在后續研究中，重離子輻照技術被逐步應用于微生物誘變育種和腫瘤治療中。余曾亮等對重離子的作用機制總結為4方面：即能量沉積、動量傳遞、離子注入和電荷交換。這四種過程在生物體內發生的理化反應，形成的生物效應，使離子注入法育種具有許多獨特的特點，這些開創性的研究工作受到國內外學術界的關注，為離子束生物工程學的發展奠定了基礎，它將對生命科學中一些重大問題的研究提供技術支撐。同樣，其在微生物育種中獨具特色，因其損傷小、突變率高、突變譜廣、誘變效果好，而受到愈來愈廣泛的關注，并取得了顯著的經濟效益和社會效益。

NTG是亞硝基胍，是一種非常強的化學誘變劑。NTG誘發的突變主要是GC-AT轉換，另外還有小范圍切除、移碼突變及GC對的缺失。利用重離子和NTG突變改變了原來的轉錄系統，從而對蛋白質翻譯能力出現一定程度的改變，以提高微生物的原油降解能力。