[發明專利]一種抗稻瘟水稻鑒定方法和基因的標記方法及其應用

有效

• 申請號: 201711080527.X
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107988337B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 孫一丁;許明輝;馬繼瓊;楊奕;李進斌
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 云南凌云律師事務所 53207
• 代理人: 董建國

本發明屬于農作物分子遺傳育種學領域，具體涉及一種抗稻瘟水稻鑒定方法和基因的標記方法及其應用，包括如下步驟：檢測待測水稻第6號染色體中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353堿基處SNP位點，通過PCR擴增及限制性內切酶酶切對水稻第6號染色體中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353堿基處SNP類型進行鑒定。本發明可以準確判斷所選擇水稻植株是否含有抗稻瘟病基因Pid2，利用這種方法可以有效地對抗稻瘟病基因pid2基因型選擇，既可以用于水稻資源的鑒定篩選，又可以用于水稻抗稻瘟病基因Pid2的分子育種。

技術領域

本發明屬于農作物分子遺傳育種學領域，涉及一種抗稻瘟水稻鑒定方法和基因的標記方法及其應用。

背景技術

水稻是世界上重要的糧食作物，稻瘟病是世界各稻區最為嚴重的病害之一，嚴重影響了水稻的產量。由于稻瘟病菌的高度變異性和不穩定性，致使新育成的具有單一抗性基因的抗性品種在推廣種植幾年后就成為感病品種，這已成為水稻生產可持續發展的重要障礙，挖掘水稻抗性基因資源是抗稻瘟病育種的基礎。通過廣泛的遺傳分析，目前已經鑒定和定位了 84 個稻瘟病抗性基因，至少24個主效基因已相繼被分離克隆。隨著水稻DNA測序技術的廣泛應用，不同抗性（表型）品種來源的同源序列比較將成為確定新功能基因的方法（Yudai Okuyama et al.，2011），水稻基因組重測序工作的開展將極大地推動包括稻瘟病抗性基因在內的基因分離克隆進程（Xu et al., 2011）。

Pid2位于水稻第6染色體的近著絲粒區域，克隆于我國秈稻品種“地谷”的為主效抗稻瘟病基因，對我國稻瘟病生理小種ZB15表現較高的葉瘟抗性，是我國南方稻瘟病育種的重要抗源。從已克隆的稻瘟病抗性基因結構來看，Pi-d2不同于傳統的“R”基因。主效抗稻瘟病基因Pi-d2源自秈稻品種地谷，對我國稻瘟病生理小種ZB15表現較高的葉瘟抗性(Chen, 2010)。Pi-d2定位于水稻第6染色體的近著絲粒區域，為單拷貝基因，編碼一長度為825個氨基酸的跨膜受體蛋白激酶(RLK)，該激酶氨基端含有疏水性信號肽、B-lectin 結構域、PAN域和TM域，羧基端是個典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域（STK）。由于以前在水稻中未發現RLK含膜外B-lectin結構，因此Pi-d2屬于新的抗病基因類型。

酶切擴增多態性序列（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS）是一類以PCR為基礎的共顯性的分子標記，它的基本原理是先用已知位點的DNA序列去設計一套特異性的PCR引物（19~27 bp），然后應用這些引物去擴增該位點上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內切酶切割所得的擴增帶并進行RFLP分析。它揭示了特異PCR產物DNA序列內限制性酶切位點變異的信息，既能檢出DNA多態性的方式，同時還具有快速、簡捷、高效等優點。

傳統常規田間表型鑒定對抗稻瘟病基因的選擇效率低，準確性差；急需一種抗稻瘟病水稻的高效育種方法。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種抗稻瘟水稻鑒定方法和基因的標記方法及其應用。利用這種方法可以有效地對抗稻瘟病基因pid2基因型選擇，既可以用于水稻資源的鑒定篩選，又可以用于水稻抗稻瘟病基因Pid2的分子育種。

具體技術方案為：

一種抗稻瘟水稻鑒定方法，通過以下步驟來實現：

（1）對稻種資源Pid2編碼區的等位基因進行PCR擴增及PCR產物測序；

（2）在水稻第6號染色體中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第 5352和5353堿基處獲得兩個Pid2特異性SNP位點；

（3）所述兩個Pid2特異性SNP位點堿基有三種情況：1）堿基類型為“AT ”，2）堿基類型為“GC”，3）堿基類型為 “GT”；