[發明專利]一種抗稻瘟水稻鑒定方法和基因的標記方法及其應用

有效

• 申請號: 201711080527.X
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107988337B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 孫一丁;許明輝;馬繼瓊;楊奕;李進斌
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 云南凌云律師事務所 53207
• 代理人: 董建國

1.一種抗稻瘟水稻鑒定方法，其特征在于，通過以下步驟來實現：

（1）對稻種資源Pid2編碼區的等位基因進行PCR擴增及PCR產物測序；

（2）在水稻第6號染色體中Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第5352和5353堿基處獲得兩個Pid2特異性SNP位點；

（3）所述兩個Pid2特異性SNP位點堿基有三種情況：1）堿基類型為“AT ”，2）堿基類型為“GC”，3）堿基類型為“GT”；

（4）若待測水稻材料5352和5353位點堿基是“AT ”，則該材料為含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候選為含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻；若待測水稻5352和5353位點處堿基堿基類型為“GC”或“GT”，則該水稻材料為不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻或候選為不含有抗稻瘟病基因Pid2的水稻。

2.根據權利要求1所述的一種抗稻瘟水稻鑒定方法，其特征在于，所述抗稻瘟水稻基因的標記方法，即檢測水稻Pid2基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第 5352和5353堿基的方法如下：

（1）以待測水稻的基因組DNA為模板，以稻瘟病抗性基因Pid2基因的分子標記引物為引物，進行PCR擴增，得到700bp大小的PCR擴增產物；

（2）用限制性內切酶Fau1和Mlu1分別對所述PCR擴增產物進行酶切，其結果有以下幾種情況：

1）所述PCR擴增產物被兩種限制性內切酶酶切后電泳均只顯示1條DNA條帶，則待測水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第 5352和5353堿基是純合的“AT ”；

2）所述PCR擴增產物能被限制性內切酶Fau1酶切后電泳顯示兩條DNA條帶，而被限制性內切酶Mlu1酶切后電泳顯示1條DNA條帶，則待測水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第 5352和5353堿基是純合的“GC”；

3）所述PCR擴增產物能被限制性內切酶Mlu1酶切后電泳顯示兩條DNA條帶，而被限制性內切酶Fau1酶切后電泳顯示1條DNA條帶，則待測水稻基因序列FJ915121.1序列及其同源序列5’末端起第 5352和5353堿基是純合的“GT”；

4）所述PCR擴增產物能被限制性內切酶Fau1酶切后電泳顯示三條DNA條帶，而被限制性內切酶Mlu1酶切后電泳顯示1條DNA條帶，則待測水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第 5352和5353堿基是雜合堿基“AT/GC ”；

5）如果所述PCR擴增產物能被限制性內切酶Mlu1酶切后電泳顯示3條DNA條帶，而被限制性內切酶Fau1酶切后電泳顯示1條DNA條帶，則待測水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第 5352和5353堿基是雜合堿基“AT/GT ”；

6）所述PCR擴增產物被兩種限制性內切酶酶切后電泳均顯示3條DNA條帶，則待測水稻基因序列FJ915121.1序列的同源序列5’末端起第5352和5353堿基是雜合“GC/GT”。

3.根據權利要求2所述的一種抗稻瘟水稻鑒定方法，其特征在于，所述引物為能擴增稻瘟病抗性基因Pid2的分子標記的引物，其序列為：

DF：5’- AAGCTTGGTCAGGGAGGGTT-3’；

Pid2 DR：5’-TGTCATTGTACTTCA GCTTGGC-3’。

4.根據權利要求2所述的一種抗稻瘟水稻鑒定方法，其特征在于，所述稻瘟病抗病基因Pid2分子標記的核苷酸序列位于FJ915121.1及其同源序列5’末端起第4870和5570核苷酸所示的序列內。

5.根據權利要求3所述的一種能擴增稻瘟病抗性基因Pid2的分子標記的引物，其特征在于，應用所述的引物及方法進行鑒定、篩選抗稻瘟病水稻。