[發明專利]利用XistTale抑制性轉錄因子R6制備新型動物細胞系R6-MEFs方法及用途

在審

• 申請號: 201711080446.X
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN109750000A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 張金噸;李喜和;范麗紅;梁延峰
• 申請（專利權）人: 內蒙古賽科星家畜種業與繁育生物技術研究院有限公司;內蒙古賽科星繁育生物技術（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
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本發明公開了一種利用Xist Tale抑制性轉錄因子R6制備新型動物細胞系R6?MEFs的方法及新型動物細胞系R6?MEFs的用途。R6?MEFs是介于野生型MEFs和小鼠多能性干細胞系之間的、可傳50代次以上的一種具有自我更新能力的新型動物細胞系；這種利用Xist Tale抑制性轉錄因子R6制備新型細胞系的方法可推廣到人、大鼠和其他實驗動物。新型動物細胞系R6?MEFs的細胞特性為癌癥研究及治療、干細胞誘導研究和動物育種模型的建立提供了新材料和新思路。

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及一種利用結合Xist第一內含子區的Tale抑制性轉錄因子制備新型動物細胞系(R6-MEFs)的方法及新型動物細胞系R6-

MEFs的用途。

背景技術

Xist(X-inactivation-specific transcript)是真哺乳亞綱動物雌性細胞中X染色體失活所必需的一種長鏈非編碼RNA(lncRNA)。在X染色體失活的過程中，Xist扮演了一個重要的角色，它連同另外兩個RNA基因(Jpx和

Ftx)和兩個蛋白質基因(Tsx和Cnbp2)組成了X染色體失活中心(XIC的英文全稱Xchromosome inactivation centre，XIC)。在雌性哺乳類細胞中，Xist 在失活X染色體上表達量上調，在失活染色體上起到較為關鍵的作用，對于調控X染色體失活起到了巨大的作用。X染色體失活發生在雌性哺乳動物中的早期胚胎發育階段，其轉錄沉默一對X染色體中的一個，從而提供雄性和雌性之間的劑量等價，即劑量補償效應。Xist在細胞重編程中發揮作用主要是通過轉錄成的Xist RNA纏繞將要失活的X染色體并使其沉默。被包裹的X染色體啟動一系列的失活路徑，包括啟動DNA甲基化、組蛋白修飾等生物學反應，實現X 染色體的失活。同時，一旦失活的X染色體需要進行重活化時，Xist RNA的轉錄水平則會受到抑制，以便于失活X染色體的重活化。

Xist在多能干細胞中的表達沉默，與多能性因子OCT4，SOX2和NANOG有著重要的關系。在胚胎干細胞中，多能性調控因子OCT4、SOX2和NANOG等結合到Xist第一內含子區，以調控和維持Xist RNA的低水平狀態。最近研究發現，在Xist第一內含子區結合的因子還包括多能性調控因子TCF3和PRDM14，以及早期胚胎發育調控因子CDX2等。此外，多能性因子出現直接與Xist調節相關，在Nanog缺失或Oct4的誘導阻遏時，Xist被上調，并且多能性因子對第一內含子的結合功能喪失。

類轉錄激活效應物(Transcriptional-activator-like effectors, TALEs)蛋白家族是來自于植物病原體-黃單胞桿菌的天然細菌效應蛋白。它與真核生物的轉錄因子相似，通過識別特異DNA序列來調節宿主基因轉錄，并促進細菌定植。人工體外合成的TALEs蛋白已經運用到基因工程的多個方面，包含具有基因組剪輯作用的類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)和起基因轉錄修飾和調控作用的Tale-dTFs等，其中Tale-dTFs包含抑制性效應因子(TALE based designer transcription Repressors,Tale R-dTF)和激活性效應因子 (TALE based designer transcription activators,Tale A-dTF)，它們的TALE 蛋白分別與抑制結構域(如KRAB等)和激活結構域(如VP64)相連接，最終通過在結合位點募集各種不同的轉錄調控因子而達到改變結合位點的表觀遺傳修飾狀態并調控靶基因開關的目的。而且，Tale-dTFs已成功地應用于MEF細胞的重編程及干細胞的分化、轉分化實驗中。

而結合于Xist第一內含子區的基于類轉錄激活效應物的抑制性體外轉錄因子(Transcriptional-activator-like effectors based designer TranscriptionFactors,Tale-dTFs)Repressor 6(以下稱R6)顯著提高了小鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonic fibroblast,MEF)向iPSC的誘導效率。