[發明專利]利用XistTale抑制性轉錄因子R6制備新型動物細胞系R6-MEFs方法及用途

在審

• 申請號: 201711080446.X
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN109750000A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 張金噸;李喜和;范麗紅;梁延峰
• 申請（專利權）人: 內蒙古賽科星家畜種業與繁育生物技術研究院有限公司;內蒙古賽科星繁育生物技術（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用Xist Tale抑制性轉錄因子R6制備新型動物細胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)載體制備及細胞建系：

利用小鼠Oct4Tale R-dTF載體改造為特異性識別和結合Xist第一內含子區的Tale R-dTF(R6)，最終形成的R6為PB載體攜帶的由Doxycycline(Dox)依賴型啟動子TRE驅動的表達載體；

在體外條件下，獲取攜帶Oct4-GFP基因的胎鼠成纖維細胞MEFs；

2)獲得新型動物細胞系R6-MEFs：

A、Oct4-GFP MEFs的脂質體轉染：

將攜帶Oct4-GFP基因的胎鼠成纖維細胞MEFs使用M10培養液培養于六孔板中，轉染30min前更換為新鮮的M15培養液2mL，放入培養箱中等待轉染；攜帶Oct4-GFP基因的胎鼠成纖維細胞MEFs達到40％-60％匯合度時，將500μL轉染體系加入M15培養液中，置于37℃、5％CO₂培養箱中培養，進行脂質體轉染；

B、脂質體轉染后R6-MEFs的誘導及建系：

a、脂質體轉染后第二天將M15培養液更換為M15+Dox培養液培養，放入37℃，5％CO₂培養箱中培養；

b、脂質體轉染后第三天熒光顯微鏡檢測轉染效率：轉染成功的細胞表達紅色熒光蛋白，更換新的M15+Dox+puro培養液，篩選具有轉基因的細胞，培養細胞三天后，絕大多數非轉基因細胞凋亡；

c、第六天更換為M15+Dox培養液培養，直至匯合度達到80％時，按照1：40進行傳代培養；隔天進行細胞生長情況的觀察，并在液體發黃時更換M15+Dox培養液；

d、細胞生長速度較快并且形成明顯克隆的細胞，將其單克隆傳入6孔板進行建系，建系成功后按比例1：40傳代和凍存。

2.根據權利要求1所述的一種利用Xist Tale抑制性轉錄因子R6制備新型動物細胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述M10培養液的配制如下：

含有10％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青鏈霉素的Knockout DMEM。

3.根據權利要求1所述的一種利用Xist Tale抑制性轉錄因子R6制備新型動物細胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述M15培養液的配制如下：

含有15％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青鏈霉素、0.1mMβ-巰基乙醇和106U/ml LIF的Knockout DMEM。

所述M15+Dox培養液為添加2μg/mL Doxcycline的M15培養液；

所述M15+Dox+puro培養液為添加2μg/mL Doxcycline和2μg/mL puromycin的M15培養液。

4.根據權利要求1所述的一種利用Xist Tale抑制性轉錄因子R6制備新型動物細胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述步驟A中轉染體系由250μL A液和250μL B液組成：A液組成成分包含245μL的OPTI-MEM和5μL的脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000；B液組成成分包含250μL的OPTI-MEM和轉染載體，A液和B液配好后分別充分混勻，于室溫孵育5min；然后將A、B液混勻靜置，室溫孵育30min。

5.根據權利要求4所述的一種利用Xist Tale抑制性轉錄因子R6制備新型動物細胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述轉染載體為轉座酶HyBase 1μg，CAG-rtTA 1μg，PGK-Puro1μg和攜帶mCherry的R6載體2μg。

6.根據權利要求1所述的一種利用Xist Tale抑制性轉錄因子R6制備新型動物細胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述步驟A的R6載體的結合位點如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA，GeneBank中參考基因序列號：NC_000086.7。