[發(fā)明專利]一種敲除釀酒酵母染色體的方法

有效

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• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107858346B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設計）人: 元英進;吳毅;周嗣杰;徐暉;李云祥
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/04
• 分類號: C12N15/04;C12N15/81;C12N15/90;C12N9/22;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉猛;趙青朵

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體公開了一種敲除釀酒酵母染色體的方法。本發(fā)明利用CRISPR/Cas9基礎技術切除酵母完整染色體，通過在著絲粒附近選擇特異性靶點，設計對應的guide RNA引導Cas9蛋白在染色體著絲粒附近產生切口，從而實現(xiàn)整條染色體的敲除。本發(fā)明與現(xiàn)有通過Gal啟動子誘導、減數(shù)分裂等方式實現(xiàn)整條染色體丟失的方法相比，更加簡單、高效、快速地實現(xiàn)釀酒酵母染色體的切割：避免姐妹染色單體的交叉互換，獲得染色體敲除后的釀酒酵母純合二倍體菌株。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體的說是涉及一種敲除釀酒酵母染色體的方法。

背景技術

生物基因組攜帶了決定生物基本性狀的遺傳信息，人工DNA合成技術和DNA大片段操作技術推動了基因組人工合成研究的進步。合成生物學的發(fā)展推動了通過人工設計合成來“寫”基因組信息標志著“人造生命”的開始。

基因組DNA長度過大，而且絕大多數(shù)真核生物具有多條染色體，且染色體長度都較大，涉及到染色體疾病或以染色體為單位的功能整合等都需要對整條染色體進行操作。如何實現(xiàn)整條染色體的敲除是一個值得探討的問題。釀酒酵母是與人類關系最廣泛的一種酵母，它用于制作面包和饅頭等食品以及釀酒，同時還可以作為微生物發(fā)酵生產化學品的工程菌。釀酒酵母有單倍體和雙倍體兩種生活形態(tài)，由于雙倍體釀酒酵母營養(yǎng)細胞大，生活能力強，工業(yè)上多用雙倍體進行生產。為了能夠進一步提高釀酒酵母的生產能力，需要對酵母的基因組進行改造，如果直接用二倍體改造，可能得到優(yōu)良菌株是雜合的，遺傳性狀不穩(wěn)定，而單倍體就成為一種很好地選擇。通過將單倍體酵母改造為一種優(yōu)良菌株，而后再通過交配重新形成優(yōu)勢的二倍體。

但是，釀酒酵母在形成二倍體的過程中，有一定幾率發(fā)生姐妹染色單體的交叉互換，還是會形成雜合二倍體。因此，對不需要的染色體及時進行敲除，能夠避免這種問題的出現(xiàn)(單倍體酵母染色體因含有大量必需基因，無法直接敲除，必須在二倍體狀態(tài)下敲除才能夠存活)。

在釀酒酵母中，還未發(fā)現(xiàn)對整條染色體的敲除技術。目前在酵母中常用的敲除技術是基因敲除技術，它是以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術，僅能對基因進行操作?，F(xiàn)有利用減數(shù)分裂時酵母染色體染色體的不均等分配來實現(xiàn)染色體的丟失的方法，在減數(shù)分裂過程中，酵母的同源染色體之間會發(fā)生同源重組，不能保證單條染色體的完整性。通過這種方法要得到完整染色體的工作量大且效率低。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種敲除釀酒酵母染色體的方法，使得所述方法能夠提高敲除整條染色體的效率，達到80％以上的敲除率，避免姐妹染色單體交叉互換對染色體的影響，確保釀酒酵母整條染色體的敲除，獲得染色體敲除后的純合二倍體酵母。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

步驟1、在待敲除的染色體著絲粒左右100bp范圍內尋找PAM序列作為guide RNA靶位點，以PAM序列上游20個堿基序列作為protospacers序列，所述PAM序列和protospacers序列不存在于與待敲除染色體的單倍體釀酒酵母交配的釀酒酵母對應的同源染色體上；

步驟2、在protospacers序列兩端構建載體同源臂序列，并形成完全互補的雙鏈DNA，通過酶切和Gibson組裝技術，與所述載體組裝，獲得guide RNA質粒；

步驟3、將待敲除染色體的單倍體釀酒酵母菌株與交配型不同得釀酒酵母菌株進行融合，構建二倍體釀酒酵母菌株，向二倍體釀酒酵母細胞中轉化Cas9質粒和guide RNA質粒，對待敲除的染色體著絲粒切割，敲除整條染色體；或

向與待敲除染色體的單倍體釀酒酵母交配的釀酒酵母中轉化Cas9質粒和guideRNA質粒，然后與待敲除染色體的單倍體釀酒酵母菌株進行融合，構建二倍體釀酒酵母菌株，并對待敲除的染色體著絲粒切割，敲除整條染色體。整體流程示意圖見圖1。