[發明專利]一種敲除釀酒酵母染色體的方法

有效

• 申請號: 201711078271.9
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107858346B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 元英進;吳毅;周嗣杰;徐暉;李云祥
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/04
• 分類號: C12N15/04;C12N15/81;C12N15/90;C12N9/22;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉猛;趙青朵

1.一種敲除釀酒酵母染色體的方法，其特征在于，包括：

步驟1、在待敲除的染色體著絲粒左右100bp范圍內尋找PAM序列作為guide RNA靶位點，以PAM序列上游20個堿基序列作為protospacers序列，所述PAM序列和protospacers序列不存在于與待敲除染色體的單倍體釀酒酵母交配的釀酒酵母對應的同源染色體上；

步驟2、在protospacers序列兩端構建載體同源臂序列，并形成完全互補的雙鏈DNA，通過酶切和Gibson組裝技術，與所述載體組裝，獲得guide RNA質粒；

步驟3、將待敲除染色體的單倍體釀酒酵母菌株與交配型不同的 釀酒酵母菌株進行融合，構建二倍體釀酒酵母菌株，向二倍體釀酒酵母細胞中轉化Cas9質粒和guide RNA質粒，對待敲除的染色體著絲粒切割，敲除整條染色體；或

向與待敲除染色體的單倍體釀酒酵母交配的釀酒酵母中轉化Cas9質粒和guide RNA質粒，然后與待敲除染色體的單倍體釀酒酵母菌株進行融合，構建二倍體釀酒酵母菌株，并對待敲除的染色體著絲粒切割，敲除整條染色體。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述載體同源臂為載體上酶切位點兩端的同源臂。

3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述酶切位點為NotI酶切位點。

4.根據權利要求2所述方法，其特征在于，所述載體為pRS42H質粒。

5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述Cas9質粒由以下方法構建獲得：

利用引物PCR擴增表達Cas9的基因，引物兩端帶酶切位點，利用酶切連接將片段與酶切后的載體構建為完整質粒。

6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1為：

在synIII人工釀酒酵母合成型III號染色體的著絲粒左右100bp范圍內尋找PAM序列作為guide RNA靶位點，以PAM序列上游20個堿基序列作為protospacers序列，所述PAM序列和protospacers序列不存在于與synIII人工釀酒酵母交配的Yyw0171釀酒酵母對應的同源染色體上。

7.根據權利要求6所述方法，其特征在于，所述PAM序列如SEQ ID NO:1所示。

8.根據權利要求6所述方法，其特征在于，所述protospacers序列如SEQ ID NO:2所示。

9.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2為：

在protospacers序列兩端，構建pRS42H質粒上NotI酶切位點兩端同源臂序列，然后形成完全互補的雙鏈DNA，通過酶切和Gibson組裝技術，與pRS42H質粒組裝，獲得guide RNA質粒。

10.根據權利要求9所述方法，其特征在于，所述pRS42H質粒上NotI酶切位點兩端同源臂序列如SEQ ID NO:3和4所示。