[發明專利]一種金屬離子檢測用探針、試劑盒、制備方法、應用

有效

• 申請號: 201711077460.4
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107860765B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 黃沛力;熊亞敏
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 鄭州先風知識產權代理有限公司 41127
• 代理人: 王俊紅

1.一種金屬離子檢測用探針，其特征在于，所述探針上修飾連接有金屬離子脫氧核酸酶序列和與金屬離子脫氧核酸酶序列互補配對連接的底物鏈序列，所述底物鏈序列的3’端修飾有能夠催化化學發光體系產生化學發光的基團分子；

所述金屬離子為銅離子；

所述脫氧核酸酶序列為：5’-GGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTA AGAAAGAAC-3’；

所述底物鏈序列的3’端修飾的基團分子為辣根過氧化物酶HRP；

所述底物鏈序列為：

5’-Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCTTCTTTCTAATACGGCTTACC-HRP-3’。

2.如權利要求1所述的金屬離子檢測用探針，其特征在于，所述金屬離子抑制底物鏈序列3’端修飾的基團分子的催化活性。

3.如權利要求1所述的金屬離子檢測用探針，其特征在于，所述探針以鏈霉親和素修飾的納米磁珠為固相載體。

4.一種如權利要求3所述的金屬離子檢測用探針的制備方法，其特征在于，包括以下操作步驟：

1）取鏈霉親和素修飾的納米磁珠，采用緩沖液1清洗后，加入緩沖液1和底物鏈，室溫避光渦旋反應，反應結束后，進行磁分離并采用緩沖液1清洗，得到結合底物鏈的納米磁珠；

2）取步驟1）制備的結合底物鏈的納米磁珠加入脫氧核酸酶序列和雜交緩沖液，溫育反應，反應結束后，得結合脫氧核酸酶序列和底物鏈的納米磁珠；

3）將步驟2）制備的納米磁珠采用緩沖液2進行清洗后，保存在緩沖液2中，即得所述的探針。

5.一種金屬離子檢測用試劑盒，其特征在于，包括如權利要求1～3任一項所述的探針。

6.如權利要求5所述的金屬離子檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于檢測銅離子，包括如權利要求3所述的探針。

7.如權利要求6所述的金屬離子檢測用試劑盒，其特征在于，還包括化學發光板、化學發光底物液、標準樣品、稀釋緩沖液、洗滌緩沖液、EDTA溶液、PBST緩沖液、樣品消化處理液、pH調節劑。

8.一種如權利要求7所述的金屬離子檢測用試劑盒在檢測血清中銅離子濃度方面的應用，其特征在于，其檢測方法包括以下操作步驟：

A：在化學發光板中加入探針，磁分離，用洗滌緩沖液清洗后，加入抗壞血酸室溫避光反應，反應結束后磁分離，并用PBST清洗后，加入化學發光底物液，測定化學發光板的發光強度，記為RLU₀；

B：在銅離子標準溶液中加入抗壞血酸，按照步驟A所述的方法在化學發光板中加入含有抗壞血酸的銅離子標準溶液，測定發光強度記為RLU，根據不同銅離子濃度對應的（RLU₀-RLU）/RLU₀的變化，繪制銅離子濃度檢測標準曲線，得（RLU₀-RLU）/RLU₀與銅離子濃度之間的對應關系式；

C：測定血清樣本總銅含量：取人血清樣本加入樣品消化處理液進行消化處理后，血清消化液用稀釋緩沖液稀釋后作為總銅待測樣品，按照步驟A同樣的方法，在總銅待測樣品中加入抗壞血酸后，檢測發光強度RLU，帶入步驟B獲得的（RLU₀-RLU）/RLU₀與銅離子濃度之間的對應關系式中，計算得出血清樣本的總銅含量；

測定血清樣本游離銅含量：取人血清樣本，加入EDTA溶液反應后，用超濾管超濾收集濾液，將濾液加入樣品消化處理液進行消化處理后，濾液消化液加入稀釋緩沖液稀釋后作為游離銅待測樣品，按照步驟A同樣的方法，在游離銅待測樣品中加入抗壞血酸后，檢測發光強度RLU，帶入步驟B獲得的（RLU₀-RLU）/RLU₀與銅離子濃度之間的對應關系式中，計算得出血清樣本的游離銅含量。

9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述稀釋緩沖液為含NaCl的0.05mol/LHEPES緩沖液，pH=7.0。