[發明專利]一種金屬離子檢測用探針、試劑盒、制備方法、應用

有效

• 申請號: 201711077460.4
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN107860765B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 黃沛力;熊亞敏
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 鄭州先風知識產權代理有限公司 41127
• 代理人: 王俊紅

本發明涉及生物傳感器金屬離子檢測技術領域，具體涉及一種金屬離子檢測用探針、試劑盒、制備方法、應用。本發明采用金屬離子脫氧核酸序列與底物鏈序列修飾探針，并在底物鏈的端部修飾對化學發光系統具有催化發光作用的基團分子，通過化學發光原理實現對金屬離子的檢測，并進一步的在底物鏈的端部修飾被金屬離子抑制活性的能夠催化化學發光系統發光的基團分子，實現催化化學發光活性抑制雙重信號放大，提高檢測靈敏度；同時該方法可以通過改變反應緩沖液離子強度實現對方法線性區間范圍的調節。具體的本發明方法結合Cu?DNAzyme對Cu?Sub的切割和Cu²⁺對HRP催化化學發光活性的抑制產生雙重信號放大。

技術領域

本發明涉及生物傳感器金屬離子檢測技術領域，具體涉及一種金屬離子檢測用探針、試劑盒、制備方法、應用。

背景技術

金屬最大的特征是失去電子成為帶正電荷的離子，因此存在于生物體液中的是各種形式的金屬離子，它們能與生物分子產生各種鍵合作用，從而在生物體內承擔各種各樣的功能，如電子轉移、載氧、酶的活性中心等。體內金屬離子過多或過少都將導致人體正常生理功能的紊亂，從而引起各種各樣的疾病。比如鐵、銅、錳、鋅等過渡金屬離子是重要的神經化學因子，它們代謝異常與神經系統的疾病緊密相關，如早期老年癡呆癥、家族肌萎性脊髓側索硬化癥和瘋牛病或克雅氏癥。

比如，銅(Cu)是生命體必需的微量元素之一，其可作為輔酶因子參與生命活動，也可以參與紅細胞的形成。隨著Cu在制造業、化工及藥物合成等領域的廣泛應用，人們通過環境暴露、職業暴露以及醫源性暴露等接觸Cu的機會越來越多，生物體攝入過量的Cu后產生的大量自由基，可造成機體氧化損傷。Cu進入血液后先與白蛋白松散結合，其中90％～98％的Cu被運送至肝臟內與α2球蛋白牢固結合形成銅藍蛋白，再釋放到血液中。根據結合Cu原子數的不同，銅藍蛋白可分為飽和銅藍蛋白和不飽和銅藍蛋白。當機體中銅藍蛋白合成障礙時，會導致血液中游離Cu含量增加，進而引起大量的自由基產生。當這些游離Cu沉積在肝、腎、腦等器官時便造成器官功能障礙。研究發現，與Cu代謝相關的疾病包括肝豆狀核變性(Wilson Disease，WD)、阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)等。因此，以血清游離Cu或血清相對游離Cu(血清游離Cu/血清總Cu)作為Cu代謝障礙相關疾病臨床診斷生物標志物及治療過程評價指標的研究越來越受到醫學界的高度關注。臨床上，血清游離Cu主要包括血清中的自由Cu以及與白蛋白、氨基酸松散結合的Cu，一般通過計算血清總Cu與銅藍蛋白結合Cu的差值得到，即：游離Cu＝血清總Cu(mg/L)-0.3×銅藍蛋白(mg/L)/100，或游離Cu＝血清總Cu(μmol/L)-0.049×銅藍蛋白(mg/L)。然而，由于采用免疫沉淀法測得的銅藍蛋白不能區分飽和銅藍蛋白和不飽和銅藍蛋白，使得銅藍蛋白結合Cu部分結果偏高，游離Cu計算結果偏低，該計算方法在超過20％的病人中得到陰性結果。血清游離Cu的其他測定方法則是采用EDTA等螯合劑將游離Cu從白蛋白等蛋白質上剝離，經超濾后通過電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)、原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)等方法進行測定，這些檢測方法雖然結果準確，靈敏度高，但所需儀器昂貴，操作難度大，樣品前處理復雜，且對操作人員要求高，在基層難以普及。因此，發展快速、靈敏、簡便的高選擇性復雜體系銅離子以及其他金屬離子的檢測方法具有重要的意義。

基于識別分子構建的生物傳感器檢測方法，由于特異性強等優點，逐漸被應用到各個領域，在金屬離子檢測等領域也存在相關的應用，相比傳統的方法能夠快速、特異地檢測目標金屬離子，但是對于生物樣本中游離的低濃度的金屬離子的檢測，往往存在靈敏度不高，檢測準確性低的缺陷。因此，如何提高基于識別分子生物傳感器檢測生物體內金屬離子的靈敏度和準確性，成為了目前亟待解決的技術問題。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種金屬離子檢測用探針，能夠快速、靈敏、準確的對目標金屬離子進行特異性的檢測。