[發(fā)明專利]核苷酸序列、使用其提高蛋白表達效率的方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711073035.8
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN109750036B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田克恭;王瑩;孫進忠;張許科
• 申請（專利權(quán)）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/12;A61K39/235;A61P31/14;A61P31/20;C12R1/19
• 代理公司: 北京華夏正合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

本發(fā)明涉及核苷酸序列、一種使用其提高蛋白表達效率的表達載體及用其制備蛋白的方法及應(yīng)用。用該表達載體無論表達單個蛋白還是多個蛋白，與常規(guī)表達載體相比，所表達的可溶性蛋白含量占整個菌體總蛋白量均較高；內(nèi)毒素含量均較低，僅需清除1次即可達到配苗要求，操作簡單。用該表達載體表達后的蛋白制備疫苗均可使靶標動物獲得完全保護。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有特定序列的核苷酸序列，使用該核苷酸序列在大腸桿菌表達系統(tǒng)表達蛋白的方法及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著世界分子生物學(xué)研究不斷深入，基因表達技術(shù)有了很大的提高，迄今為止，人們已經(jīng)研究開發(fā)出多種原核、真核表達系統(tǒng)用以生產(chǎn)外源蛋白。在各種表達系統(tǒng)中，大腸桿菌表達系統(tǒng)因其遺傳背景清楚、低成本、操作簡便、特征明確、可以大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點，使之成為目前最常用的外源蛋白表達系統(tǒng)。

但在外源基因表達過程中，外源基因在宿主細胞中的表達水平受多種因素的影響，如目的基因本身特性、轉(zhuǎn)錄效率、mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等。其中，目的基因的序列影響至關(guān)重要，若目的基因序列本身的特征如稀有密碼子、終止子、二級結(jié)構(gòu)等常會影響其蛋白的表達水平；若目的基因含有較多的稀有密碼子，常會造成重組蛋白的表達水平較低；若稀有密碼子集中出現(xiàn)在氨基端，則情況更為嚴重；目的基因中堿基突變會產(chǎn)生意外的終止密碼子從而導(dǎo)致蛋白翻譯水平的下降；mRNA轉(zhuǎn)錄子中復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)也會干擾翻譯的起始和延伸。這些原因?qū)е麓竽c桿菌表達系統(tǒng)對外源基因的原始基因序列直接進行表達時，往往存在表達效率低、表達后的蛋白為包涵體蛋白或可溶性蛋白含量低、以及內(nèi)毒素含量高等問題。

故而，大腸桿菌表達系統(tǒng)表達蛋白時一般需要先對原始基因序列進行密碼子優(yōu)化，以試圖提高表達效率，但即便如此，仍然存在表達效率不高、活性不夠、內(nèi)毒素含量較高需要復(fù)雜處理、表達過程中所產(chǎn)生的雜蛋白難以徹底去除等技術(shù)難題，用其制備的疫苗會使動物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而降低了目的蛋白對機體的免疫效果。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。

當本發(fā)明的上述核苷酸序列重組到表達蛋白基因序列前，能大大提高mRNA的翻譯起始效率，在使用相同蛋白基因序列，不對其基因序列進行密碼子優(yōu)化的條件下，也能高效表達目的蛋白。

本發(fā)明還提供了一種核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為SEQ ID No.1的3′端連接SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

本發(fā)明的上述核苷酸序列重組到表達蛋白基因序列前，能進一步提高目的蛋白的表達。

本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，所述重組載體起始密碼子之后、蛋白編碼序列之前為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，所述重組載體起始密碼子之后、蛋白編碼序列之前為SEQ ID No.1的3′端連接SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子含有上述的重組載體。

本發(fā)明還提供了一種使用所述重組載體提高表達效率的表達蛋白的方法，所述方法包括：步驟(1)將含所述蛋白基因的所述重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，所述重組載體為重組表達載體；以及步驟(2)表達所述蛋白。

本發(fā)明的用所述重組載體表達蛋白的方法，能在使用相同蛋白基因序列，不對其基因序列進行密碼子優(yōu)化的條件下，高效表達目的蛋白；且表達的蛋白為可溶性蛋白，且可溶性蛋白的表達量占整個菌體總蛋白的含量較高。

本發(fā)明還提供了使用上述表達方法制備的抗原蛋白。

本發(fā)明的上述表達方法制備的抗原蛋白中，內(nèi)毒素含量很低，使得后續(xù)的疫苗制備過程中降低了內(nèi)毒素去除的難度，使得疫苗的制備操作更簡單。