[發明專利]一種快速檢測家牛Y染色體單倍型組構成的方法

在審

• 申請號: 201711072105.8
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN107653305A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 馬志杰;夏小婷;李瑞哲;陳生梅;雷初朝;徐驚濤
• 申請（專利權）人: 青海省畜牧獸醫科學院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司61200
• 代理人: 王霞

技術領域

本發明屬于畜牧獸醫技術領域，涉及一種快速檢測家牛Y染色體單倍型組構成的方法。

背景技術

Y染色體具有遵循父系遺傳、單倍型完整等特點，對探究哺乳動物父系遺傳多樣性、群體遺傳結構、遷徙路線、起源和進化等問題具有重要的科學價值。家牛(包括普通牛和瘤牛)Y染色體單核苷酸多態位點(Y-SNPs)的研究表明：家牛由3種Y染色體單倍型組構成，包括Y1和Y2兩種普通牛單倍型組和Y3瘤牛單倍型組( et al.2005,Ginja et al.2009)。然而，在當前國內外家牛Y染色體單倍型組構成的研究中，研究者大多采用存在于Y染色體標記上的多個Y-SNPs的聯合定型分析來確定各家牛品種的單倍型組構成，進而對其父系支系組成和起源做出推斷(Ginja et al.2010,Pérez-Pardal et al.2010,Cortés et al.2011,Edwards et al.2011,常振華2011,Li et al.2013a,Li et al.2013b,Zhang et al.2013,Yue et al.2014)，這種聯合定型的方法耗時耗力、費用相對較高，在一定程度上影響家牛Y染色體單倍型組構成的檢測效率。

為了能夠快速準確、經濟可靠的確定這3種單倍型組在不同家牛品種內的分布狀況，進而揭示其群體父系遺傳結構和起源，Bonfiglio等(2012)基于Y染色體USP9Y(Y-linked Ubiquitin-specific Protease 9)基因內含子26上1個81bp的插入和1個限制性酶切位點發展出了一種只借助于PCR擴增和酶切電泳就可以鑒別這3種家牛單倍型組的方法。然而，該方法雖然提高了檢測效率，但是需要借助酶切分析，操作相對繁瑣，不夠簡便，檢測耗時也較長。除上述研究之外，目前尚未見其他簡單可行、快速準確、費用較低的鑒別這3種家牛單倍型組的方法報道。

發明內容

為了克服上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種快速檢測家牛Y染色體單倍型組構成的方法，該方法能夠快速簡便、省時省力、經濟可靠地確定家牛品種的Y染色體單倍型組成，結果準確可靠，能夠提高家牛品種的父系支系組成檢測效率。

本發明是通過以下技術方案來實現：

本發明公開的一種快速檢測家牛Y染色體單倍型組構成的方法，包括以下步驟：

1)樣品采集和基因組DNA提取

采集待檢測牛的血樣或耳組織，提取待檢測牛的基因組DNA，備用；

2)引物合成和PCR擴增

以家牛Y染色體ZFY-10標記引物序列合成1對引物，以步驟1)提取的基因組DNA為模板DNA，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，其中：

上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；

下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；

3)測序、單倍型組定型分析

將步驟2)獲得的待檢測牛的PCR擴增產物進行正、反向測序，測序引物為擴增引物，得到待檢測牛的ZFY-10標記測序序列結果，進行序列比對分析，檢測核苷酸變異位點，依據該標記的核苷酸變異位點確定單倍型組類型；

在測定的序列比對中：

若待檢測牛所測序列中存在GT缺失，則直接判定該頭牛屬于普通牛Y1單倍型組，此時SNP位點為C核苷酸；

若待檢測牛所測序列中不存在GT缺失，則看SNP位點的C>T核苷酸類型，如果SNP位點為C核苷酸，則判定該頭牛為普通牛Y2單倍型組，反之，如果SNP位點為T核苷酸，則判定為Y3瘤牛單倍型組。

優選地，本發明方法可以同時檢測多頭牛的Y染色體單倍型組構成，只需要分別采集血樣或耳組織提取基因組DNA，然后進行引物合成和PCR擴增，測序、分析比對后進行單倍型組的構成判斷和確認。

優選地，步驟1)中，采用基因組DNA提取試劑盒提取待檢測牛的基因組DNA，稀釋至終濃度為25～50ng/μL，備用。

優選地，步驟2)中，PCR擴增的反應體系共計25μL，包括：

優選地，步驟2)中，PCR擴增時反應程序為：98℃變性10s，52℃退火15s，72℃延伸10s，重復35個循環后冷卻至4℃保存。

優選地，步驟2)中，擴增長度為286bp。

優選地，步驟3)中，將待檢測牛的PCR擴增產物進行正、反向測序后，將測序結果用Chromas 2.6.4軟件進行核實，得到每頭公牛的ZFY-10標記測序序列結果。