[發(fā)明專利]一種快速檢測家牛Y染色體單倍型組構(gòu)成的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711072105.8
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN107653305A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬志杰;夏小婷;李瑞哲;陳生梅;雷初朝;徐驚濤
• 申請（專利權(quán)）人: 青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司61200
• 代理人: 王霞

1.一種快速檢測家牛Y染色體單倍型組構(gòu)成的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)樣品采集和基因組DNA提取

采集待檢測牛的血樣或耳組織，提取待檢測牛的基因組DNA，備用；

2)引物合成和PCR擴(kuò)增

以家牛Y染色體ZFY-10標(biāo)記引物序列合成1對引物，以步驟1)提取的基因組DNA為模板DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中：

上游引物序列如SEQ ID NO：1所示；

下游引物序列如SEQ ID NO：2所示；

3)測序、單倍型組定型分析

將步驟2)獲得的待檢測牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正、反向測序，測序引物為擴(kuò)增引物，得到待檢測牛的ZFY-10標(biāo)記測序序列結(jié)果，再進(jìn)行序列比對分析，檢測核苷酸變異位點(diǎn)，依據(jù)該標(biāo)記的核苷酸變異位點(diǎn)確定待檢測牛的單倍型組類型；

在測定的序列比對中：

若待檢測牛所測序列中存在GT缺失，則直接判定該頭牛屬于普通牛Y1單倍型組，此時(shí)SNP位點(diǎn)為C核苷酸；

若待檢測牛所測序列中不存在GT缺失，則看SNP位點(diǎn)的C>T核苷酸類型，如果SNP位點(diǎn)為C核苷酸，則判定該頭牛為普通牛Y2單倍型組，反之，如果SNP位點(diǎn)為T核苷酸，則判定為Y3瘤牛單倍型組。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測家牛Y染色體單倍型組構(gòu)成的方法，其特征在于，步驟1)中，采用基因組DNA提取試劑盒提取待檢測牛的基因組DNA，稀釋至終濃度為25～50ng/μL，備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測家牛Y染色體單倍型組構(gòu)成的方法，其特征在于，步驟2)中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系共計(jì)25μL，包括：

2×PrimeSTAR Max Premix 10.5μL；

上游引物 0.5μL；

下游引物 0.5μL；

模板DNA 1μL；

超純水 12.5μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測家牛Y染色體單倍型組構(gòu)成的方法，其特征在于，步驟2)中，PCR擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃變性10s，52℃退火15s，72℃延伸10s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)后冷卻至4℃保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測家牛Y染色體單倍型組構(gòu)成的方法，其特征在于，步驟2)中，擴(kuò)增長度為286bp。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測家牛Y染色體單倍型組構(gòu)成的方法，其特征在于，步驟3)中，將待檢測牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正、反向測序后，將測序結(jié)果用Chromas 2.6.4軟件進(jìn)行核實(shí)，得到每頭公牛的ZFY-10標(biāo)記測序序列結(jié)果。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測家牛Y染色體單倍型組構(gòu)成的方法，其特征在于，步驟3)中，采用BioEdit 7.2.5軟件進(jìn)行序列比對分析，檢測核苷酸變異位點(diǎn)。