[發(fā)明專利]一種凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711072088.8
• 申請(qǐng)日: 2017-11-03
• 公開（公告）號(hào): CN107576790A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李博
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市巴德生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/533
• 分類號(hào): G01N33/533;G01N15/14;C07K14/73;C12N5/0781;C12N5/0783
• 代理公司: 廣東深宏盾律師事務(wù)所44364
• 代理人: 康宇寧

1.一種凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)收集人外周血細(xì)胞，經(jīng)過密度梯度離心，收集人外周淋巴細(xì)胞；

2)使用含有血清的磷酸鹽緩沖液或者漢克氏液(Hank’s buffer)沖洗；

3)加入抗人CD4抗體，孵育、離心后，收集細(xì)胞，重新在磷酸鹽緩沖液或Hank’s液中懸浮細(xì)胞，洗脫未結(jié)合的多余抗體，離心收獲抗體標(biāo)記的細(xì)胞；

4)將收獲的細(xì)胞，加入固定液，使用震蕩或者吹打的方式，充分混勻后，避光固定；

5)洗脫固定液，使用流式細(xì)胞儀，計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，在細(xì)胞凍干保護(hù)緩沖液中，稀釋陽性細(xì)胞；

6)將含有細(xì)胞的溶液分裝后冷凍；

7)抽真空凍干，至瓶內(nèi)容物為白色或者淡黃色粉、餅狀；

8)從凍干機(jī)中取出，快速封口，保存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品的制備方法，其特征在于：所述步驟1)中，經(jīng)靜脈采血或者沖洗血沉棕黃層，收集人外周血細(xì)胞，將細(xì)胞懸液平鋪在蔗糖溶液或者商品化的人淋巴細(xì)胞分離液上，離心，使得不同密度的細(xì)胞聚集，收集人外周淋巴細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品的制備方法，其特征在于：所述步驟3)中，加入抗人CD4抗體，避光，15-30℃孵育15-30分鐘，經(jīng)過離心，收集細(xì)胞，重新在磷酸鹽緩沖液或Hank’s液中懸浮細(xì)胞，洗脫多與抗體，離心收獲標(biāo)記后的細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品的制備方法，其特征在于：所述步驟4)中，將收獲的細(xì)胞，按照10³-10⁸個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度，加入固定液，使用震蕩或者吹打的方式，充分混勻后，在2-30℃，避光，固定0.25-48小時(shí)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品的制備方法，其特征在于：所述步驟5)中，稀釋陽性細(xì)胞濃度在10²-10⁸個(gè)細(xì)胞/毫升。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品的制備方法，其特征在于：所述步驟6)中，將含有細(xì)胞的溶液分裝成0.2-2毫升/瓶，置于-80至-20℃，冷凍4-72小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品的制備方法，其特征在于：所述步驟7)中，抽真空凍干12-96小時(shí)。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品的制備方法，其特征在于：所述步驟8)中，從凍干機(jī)中取出，快速封口，在-20-8℃條件下保存。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的方法制備得到的凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品。