[發(fā)明專利]一種凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711072088.8
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN107576790A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李博
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市巴德生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N15/14;C07K14/73;C12N5/0781;C12N5/0783
• 代理公司: 廣東深宏盾律師事務(wù)所44364
• 代理人: 康宇寧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明申請涉及一種凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品及其制備方法，屬于免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

白細(xì)胞分化抗原是白細(xì)胞(還包括血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞等)在正常分化成熟不同譜系(lineage)和不同階段以及活化過程中，出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記。它們大都是穿膜的蛋白或糖蛋白，含胞膜外區(qū)、穿膜區(qū)和胞漿區(qū)。簇分化抗原(cluster of differentiation，CD)T細(xì)胞在分化成熟過程中，不同的發(fā)育階段和不同亞類的淋巴細(xì)胞可表達(dá)不同的分化抗原，這是區(qū)分淋巴細(xì)胞的重要標(biāo)志。

人外周血中T淋巴細(xì)胞亞群測定的臨床意義：CD4細(xì)胞為輔助性T細(xì)胞，是調(diào)控免疫反應(yīng)最重要的樞紐細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞下降，常見于某些病毒感染性疾病，如艾滋病、巨細(xì)胞病毒感染；而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動(dòng)期CD4+T細(xì)胞則升高。另外，由于艾滋病病毒攻擊對象是CD4細(xì)胞，所以其檢測結(jié)果對艾滋病治療效果的判斷和對患者免疫功能的判斷有重要作用。臨床背景：T細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞。其免疫源一般為寄生原生動(dòng)物、真菌、外來的細(xì)胞團(tuán)塊(例如，移植器官或被病毒感染的自身細(xì)胞)，在抗感染免疫中，細(xì)胞免疫主要參與對胞內(nèi)寄生的病原微生物的免疫應(yīng)答及對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，參與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和自身免疫病的形成，參與移植排斥反應(yīng)及對體液免疫的調(diào)節(jié)。

目前流式細(xì)胞法用于臨床檢測時(shí)所采用的質(zhì)控品有全血(例如CDChex和)和液氮凍存細(xì)胞等。這些參照物已經(jīng)被廣泛使用，但是存在以下問題：1.儲存和運(yùn)輸條件苛刻，需要低溫(2-8℃)或者超低溫(-80℃)；2.儲存周期短，全血的保存期限為3個(gè)月；3.使用過程復(fù)雜，例如液氮凍存細(xì)胞需要先進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇。同一種參照品不能用于不同的設(shè)備或檢測平臺，一次不同的設(shè)備之間不同兼容，設(shè)備需要和試劑配套使用，不同設(shè)備間的數(shù)據(jù)不能進(jìn)行對照。

目前細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)在流式細(xì)胞儀檢測中的臨床意義越顯重要，目前進(jìn)行細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)常用的方法有：⑴微球類，使用計(jì)數(shù)微球進(jìn)行細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)的問題在于：試劑價(jià)格昂貴；容易因電壓調(diào)節(jié)過高等原因使微球超出數(shù)據(jù)采集范圍，導(dǎo)致檢測失敗，因而對于操作者的技能要求較高。⑵進(jìn)樣量固定的流式細(xì)胞儀，可以每次收集固定體積的樣本量，再根據(jù)進(jìn)樣量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。這種方式所存在的問題：需要每次使用記數(shù)微球進(jìn)行校對，而微球試劑的價(jià)格較高，同時(shí)由于微球和細(xì)胞性狀的差異(微球不含有內(nèi)容物)，在采集數(shù)據(jù)時(shí)，微球容易超出采集范圍。因此，亟需提供一種便于數(shù)據(jù)采集，成本較低的校對品/參照品。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明申請的目的是提供一種凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品及其制備方法。

具體來說，本發(fā)明申請所述的凍干人淋巴細(xì)胞CD4表面抗原質(zhì)控品的制備方法，包括如下步驟：

1.收集人外周血細(xì)胞，經(jīng)過密度梯度離心，收集人外周淋巴細(xì)胞；

2.使用含有血清的磷酸鹽緩沖液或者漢克氏液(Hank’s buffer)沖洗；

3.加入抗人CD4抗體，孵育、離心后，收集細(xì)胞，重新在磷酸鹽緩沖液或Hank’s液中懸浮細(xì)胞，洗脫未結(jié)合的多余抗體，離心收獲抗體標(biāo)記的細(xì)胞；

4.將收獲的細(xì)胞，加入固定液，使用震蕩或者吹打的方式，充分混勻后，避光固定；

5.洗脫固定液，使用流式細(xì)胞儀，計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，在細(xì)胞凍干保護(hù)緩沖液中，稀釋陽性細(xì)胞；

6.將含有細(xì)胞的溶液分裝后冷凍；

7.抽真空凍干，至瓶內(nèi)容物為白色或者淡黃色粉、餅狀；

8.從凍干機(jī)中取出，快速封口，保存。

進(jìn)一步的，所述步驟1)中，經(jīng)靜脈采血或者沖洗血沉棕黃層(Buffy coat)，收集人外周血細(xì)胞，將細(xì)胞懸液平鋪在蔗糖溶液或者商品化的人淋巴細(xì)胞分離液上，離心，使得不同密度的細(xì)胞聚集，收集人外周淋巴細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述步驟3)中，加入抗人CD4抗體，避光，15-30℃孵育15-30分鐘。經(jīng)過離心，收集細(xì)胞。重新在磷酸鹽緩沖液或Hank’s液中懸浮細(xì)胞，洗脫未結(jié)合的多余抗體，離心收獲抗體標(biāo)記的細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述步驟4)中，將收獲的細(xì)胞，按照10³-10⁸個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度，加入固定液，使用震蕩或者吹打的方式，充分混勻后，在2-30℃，避光，固定0.25-48小時(shí)。

進(jìn)一步的，所述步驟5)中，稀釋陽性細(xì)胞濃度在10²-10⁸個(gè)細(xì)胞/毫升。