[發明專利]一種凍干NK細胞表面抗原質控品及其制備方法

在審

• 申請號: 201711071957.5
• 申請日: 2017-11-03
• 公開（公告）號: CN107576789A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發明（設計）人: 李博
• 申請（專利權）人: 深圳市巴德生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N15/14;C12N5/0783
• 代理公司: 廣東深宏盾律師事務所44364
• 代理人: 康宇寧

技術領域

本發明申請涉及一種凍干NK細胞表面抗原質控品及其制備方法，屬于免疫學檢測技術領域。

背景技術

白細胞分化抗原是白細胞(還包括血小板、血管內皮細胞等)在正常分化成熟不同譜系(lineage)和不同階段以及活化過程中，出現或消失的細胞表面標記。它們大都是穿膜的蛋白或糖蛋白，含胞膜外區、穿膜區和胞漿區。簇分化抗原(cluster of differentiation，CD)T細胞在分化成熟過程中，不同的發育階段和不同亞類的淋巴細胞可表達不同的分化抗原，這是區分淋巴細胞的重要標志。

流式細胞檢測方法是一種高通量的細胞或者微粒的分析方法，其主要應用于細胞性狀、膜蛋白和胞內物質的分析。在臨床診斷和科研領域被廣泛應用。其中人外周血中CD3-/CD16+/CD56+細胞為自然殺傷(NK)細胞，其測定的臨床意義：NK細胞是天然殺傷細胞，其靶細胞主要有某些腫瘤細胞(包括部分細胞系)、病毒感染細胞、某些自身組織細胞(如血細胞)、寄生蟲等，因此NK細胞是機體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，還可以合成和分泌多種細胞因子，發揮調節免疫和造血作用，作為免疫細胞治療的一種手段，參與第II型超敏反應和移植物抗宿主反應，檢測器官移植后受體反應。

目前流式細胞法用于臨床檢測時所采用的質控品有：1.全血(例如CDChex和)；2.液氮凍存細胞等。這些參照物已經被廣泛使用，但是存在以下問題：儲存和運輸條件苛刻，需要低溫(2-8℃)或者超低溫(-80℃)；儲存周期短，全血的保存期限為3個月；使用過程復雜，例如液氮凍存細胞需要先進行細胞復蘇。同一種參照品不能用于不同的設備或檢測平臺，一次不同設備間的數據不能進行對照。因此，亟需提供一種便于數據采集，成本較低的校對品/參照品。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明申請的目的是提供一種凍干NK細胞表面抗原質控品及其制備方法。

具體來說，本發明申請所述的凍干NK細胞表面抗原質控品的制備方法，包括如下步驟：

1.收集人外周血細胞，經過密度梯度離心，收集人外周淋巴細胞；

2.使用含有血清的磷酸鹽緩沖液或者漢克氏液(Hank’s buffer)沖洗；

3.加入抗人CD3和抗人CD16、CD56抗體，避光，孵育，經過離心，收集細胞，重新在磷酸鹽緩沖液或Hank’s液中懸浮細胞，洗脫未結合的多余抗體，離心收獲抗體標記的細胞；

4.將收獲的細胞，加入固定液，使用震蕩或者吹打的方式，充分混勻后，避光固定；

5.洗脫固定液，使用流式細胞儀，計陽性細胞數，根據計數結果，在細胞凍干保護緩沖液中，稀釋陽性細胞；

6.將含有細胞的溶液分裝后冷凍；

7.抽真空凍干，至瓶內容物為白色或者淡黃色粉、餅狀；

8.從凍干機中取出，快速封口，保存。

進一步的，所述步驟1)中，經靜脈采血或者沖洗血沉棕黃層(Buffy coat)，收集人外周血細胞，將細胞懸液平鋪在蔗糖溶液或者商品化的人淋巴細胞分離液上，離心，使得不同密度的細胞聚集，收集人外周淋巴細胞。

進一步的，所述步驟3)中，加入抗人CD3和抗人CD16、CD56抗體，避光，15-30℃孵育15-30分鐘，經過離心，收集細胞，重新在磷酸鹽緩沖液或Hank’s液中懸浮細胞，洗脫未結合的多余抗體，離心收獲抗體標記的細胞。

進一步的，所述步驟4)中，將收獲的細胞，按照10³-10⁸個細胞/毫升的濃度，加入固定液，使用震蕩或者吹打的方式，充分混勻后，在2-30℃，避光，固定0.25-48小時。

進一步的，所述步驟5)中，稀釋陽性細胞濃度為10²-10⁸個細胞/毫升。

進一步的，所述步驟6)中，將含有細胞的溶液分裝成0.2-2毫升/瓶，置于-80至-20℃，冷凍4-72小時。

進一步的，所述步驟7)中，抽真空凍干12-96小時。

進一步的，所述步驟8)中，從凍干機中取出，快速封口，在-20-8℃條件下保存。

本發明申請還提供根據上述方法制備得到的凍干NK細胞表面抗原質控品。

本發明申請的有益效果在于：

1.預標記的陽性凍干細胞在-20℃的條件下可以保存4-6年，在同一個批次的產品件不需要進行對照驗證，相較于全血節省了每兩個月需要進行的不同批次產品的對照驗證；