[發明專利]表征微生物中抗生素抗性的方法和設備

在審

• 申請號: 201711066853.5
• 申請日: 2010-08-19
• 公開（公告）號: CN107881210A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: T·M·魯威德;J·J·A·范坎朋;A·F·范貝爾庫姆;W·H·F·格森斯;G·P·胡弗
• 申請（專利權）人: 伊拉斯謨大學鹿特丹醫藥中心
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12Q1/10;C12Q1/6872
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所11038
• 代理人: 羅菊華

本申請是申請日為2010年8月19日、發明名稱為“表征微生物中抗生素抗性的方法和設備”的中國發明專利申請No.201080068659.0的分案申請。

技術領域

本發明涉及細菌診斷學領域，特別涉及一種表征微生物的抗生素抗性的方法、實施本發明方法的試劑盒以及用于表征微生物的抗生素抗性的系統，其包括用于實施本發明的方法的質譜分析裝置以及樣品制備材料。

背景技術

抗生素抗性是微生物抵御抗生素作用的能力。這種抗性通過基因突變和微生物間的質粒交換而發生?？股乜剐砸褜︶t學產生主要影響，而這種影響在未來數年只會增長。

因表現出抗生素抗性而重新獲得興趣的一組機會微生物是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)。這些菌種(包括，例如，克雷伯菌(Klebsiella spp)和大腸桿菌(Escherichia coli))包括機會病原體，這些機會病原體已與尿路感染、敗血癥、呼吸道感染以及腹瀉尤其相關。早在三十年前，人們便了解這些菌種對第三代頭孢菌素(例如氧亞氨基β-內酰胺)具有抗性，但是從那時才開始記錄抗性的指數增長。菌株通過生成分子A類β-內酰胺酶的稱為超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)獲得其抗性，所述酶能夠滅活第三代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢泊肟)和單環內酰胺(氨曲南)。ESBL是常見β-內酰胺酶(例如TEM和SHVβ-內酰胺酶)的衍生物，這種衍生物在酶的活性部位附近進行一次或多次氨基酸置換，從而增加其對第三代頭孢菌素和單環內酰胺的親和力以及水解活性。新一代頭孢菌素的廣泛使用促使進化出了更多種類的ESBL。ESBL由可轉移的接合質粒編碼，這些接合質粒負責將抗性傳播給其他的革蘭氏陰性菌。

根據其物理特性，ESBL被區分為450多種，克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦對ESBL有不同程度的抑制，這一特性可用于在實驗室中檢測ESBL。目前，在臨床微生物學實驗室中僅采用表型ESBL檢測試驗。分子(基因型)試驗正處于開發階段。然而，分子試驗存在的問題在于基因型和表型之間缺少100％的相關性。因此，包括ESBL生成細菌在內的任何細菌表型的分子試驗的預測值均受到限制。

一般情況下，目前的實驗室表型試驗較之ESBL基因型確證試驗更具有靈敏性和針對性。所有的表型ESBL檢測試驗依據同樣的原理：試驗評估在β-內酰胺類抗生素存在時或β-內酰胺類抗生素與β-內酰胺酶抑制劑組合存在時，對細菌生長的抑制作用的變化情況。還有一些從商業渠道獲得的各種人工試驗和自動化平臺，可用于實施這些表型試驗。人工試驗采用浸有β-內酰胺類抗生素或β-內酰胺類抗生素與β-內酰胺酶抑制劑組合的圓盤或試片。浸透的材料放置在固體培養基中，培養基事先接種了已知密度的細菌懸浮液。之后進行過夜培養，通過觀察確定生長抑制的情況，并根據抑菌圈的直徑對生長抑制的情況進行定量分析。自動化系統建立在細菌生長測量的基礎之上，測量細菌在不同濃度的β-內酰胺類抗生素存在時或β-內酰胺類抗生素與β-內酰胺酶抑制劑組合存在時的細菌生長情況。在4到18小時之后，獲得此類系統的結果。

目前，需要能夠更為迅速地診斷ESBL生成細菌的設備和方法。同時，也需要可以用于臨床微生物學實驗室的ESBL檢測試驗以便在酶動力學方面表征ESBL，從而可以跟蹤進化趨勢，并評估和預測抗生素治療中的有效劑量。一般來說，這些設備廣泛地應用于表征微生物的抗生素抗性。

發明概述

本發明現提供用于快速診斷產生抗生素修飾酶的微生物、尤其是(在優選實施方式中)生成ESBL的微生物的設備和方法。本發明還提供了可表征抗生素修飾酶本身的設備和方法。此類表征可提早檢測出新型抗性。

第一方面，本發明提供了一種用于表征微生物的抗生素抗性的方法，所述方法包括以下步驟：

a)提供抗微生物化合物或其酶修飾產物、其分子靶標或者其修飾酶底物化合物的參考質譜；

b)使微生物、其細胞裂解物或其生長培養基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，從而提供被暴露的樣品；

c)獲取被暴露樣品的質譜；

d)比較在c)步驟中獲取的質譜和在a)步驟中的參考質譜，以及

e)從所述比較中確定在所述暴露后是否出現所述抗微生物化合物、其修飾產物或所述底物的修飾，或者其分子靶標是否過量生成，并確立在觀察到所述修飾時所述微生物對所述抗微生物化合物潛在地存在抗性。