[發明專利]虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑

在審

• 申請號: 201711066299.0
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107586327A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 遲長鳳;朱陽;孫連蓮;曹子豪;呂振明;黃偉
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/10
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 吳秉中

1.虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑，其特征在于包括虎斑烏賊神經肽FMRFamide，所述神經肽FMRFamide基因cDNA序列全長約1856 bp，開放閱讀框996 bp，編碼331個氨基酸，5’非翻譯區334 bp，3’非翻譯區526 bp，前體蛋白預測相對分子質量38.7kDa，等電點9.09。

2.根據權利要求1所述的虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑，其特征在于：所述的神經肽FMRFamide生殖調控劑的制備方法包括總RNA提取、cDNA第一鏈的合成、虎斑烏賊FMRFamide基因核心序列片段的簡并引物合成、虎斑烏賊FMRFamide核心序列的擴增、RACE獲得FMRFamide基因cDNA的全長和序列信息分析。

3.根據權利要求2所述的虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑，其特征在于：所述的總RNA提取：在虎斑烏賊腦組織中加入質量體積比為0.05~0.07mg：1μL Trizol，勻漿，補加等體積的Trizol，輕輕搖晃后靜置；加入氯仿，劇烈震蕩后靜置，高速離心，取最上層的上清液；加入異丙醇搖勻，靜置，離心，除去上清液，保留沉淀；加入70~80%的乙醇，用槍頭吹吸沉淀，高速離心，用槍頭吸除液體部分，保留沉淀；室溫靜置15~25分鐘待RNA呈半干的透明狀態，用DEPC水溶解后，得到虎斑烏賊總RNA液。

4. 根據權利要求2所述的虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑，其特征在于：所述的cDNA第一鏈的合成為：將虎斑烏賊總RNA液點樣到1%的瓊脂糖凝膠上跑膠，并在UVP紫外凝膠成像儀中呈像，進一步經紫外分光光度計測定其A260/A280值在1.8-2.0之間，可作為模板進一步用于cDNA第一鏈合成；使用Takara公司生產的M-MLV（Rnase H^-）反轉錄試劑盒，利用虎斑烏賊腦組織提取的總RNA進行cDNA第一條鏈合成實驗。

5. 根據權利要求2所述的虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑，其特征在于：所述的虎斑烏賊FMRFamide基因核心序列片段的簡并引物合成：將合成的cDNA置于-30~-15℃保存備用；根據NCBI數據庫中獲得已報道的軟體動物物種FMRFamide基因序列，通過分析氨基酸序列的保守區，合成了多對用來克隆虎斑烏賊FMRFamide基因核心序列片段的簡并引物：FMRF-F：GCTGAAGATGAACTGGAAGAG；FMRF-R：CAAAWAACTGAATGWCGCAGG；FMRF-5'outer：GATGTCTCTAGCTTGCTTCC；FMRF-5'inner：GATGGAGCCGCACACACAGAC；FMRF-3'outer：GAAACCCTGAGGACCAAGAAGCTGACAA；FMRF-3'inner：GGCGGTGAAGACGATGACGTGAACT；M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC；5’RACEAdapter：GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG；5’RACEOuterPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA；5’RACEInnerPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGA；3’RACEAdapter ：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；3’RACEOuterPrimer ：GCGGATCCGAATTAATACGACT；3’RACEInnerPrimer：GCGAGCACAGAATTAATACGACT。

6. 根據權利要求2所述的虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑，其特征在于：所述的虎斑烏賊FMRFamide核心序列的擴增：以虎斑烏賊腦組織cDNA作為模板，簡并引物FMRFamide-F和FMRFamide-R進行FMRFamide基因核心片段的PCR擴增；PCR反應程序為：94℃ 5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30個循環；72℃ 8min；電泳檢查產物，用QIAGEN公司的DNA凝膠回收試劑盒回收純化后，將其與pMD18-T載體相連接，轉化至E.coli5α感受態細胞中，進行PCR檢測后，將陽性克隆產物進行測序。