[發明專利]虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑

在審

• 申請號: 201711066299.0
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107586327A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 遲長鳳;朱陽;孫連蓮;曹子豪;呂振明;黃偉
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/10
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明涉及神經肽技術領域，本發明具體是一種虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑。

背景技術

頭足類（Cephalopoda）屬于軟體動物門頭足綱，廣泛分布在各個海域，在生物的系統演化的過程中占有重要地位。其肉質鮮美可口，肌肉含有相當豐富的營養物質，尤其是蛋白含量非常高。除了可以被食用外，更重要的是還具有重要的研究價值，其墨囊可以促進血液凝固且還含有抗菌成分，海螵蛸可以用作醫學藥材，耳石可以用來分析物種存在的年輪和海洋環境隨時間和空間的變化特點。另外頭足類還是海洋生態系統中重要的生物因子，在生態系統食物鏈中作為捕食者和被捕食者，對維持海洋生態系統的穩定具有重要的作用。

神經肽是廣泛存在于動物體內的小分子多肽，由神經組織分泌，具有調節神經活動、機體生長、發育等各種生理功能，神經肽同時還能充當生長因子、營養因子等信息分子。神經肽是一類比較古老的信息分子，真菌乃至細菌體內都存在神經肽。

發明內容

本發明的目的在于提供一種虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑，可準確快速的調控虎斑烏賊的生殖活動，用于優化我國虎斑烏賊的規模化人工繁殖。

本發明針對背景技術中提到的問題，采取的技術方案為：虎斑烏賊神經肽FMRFamide生殖調控劑，其特征在于包括虎斑烏賊神經肽FMRFamide，所述神經肽FMRFamide基因cDNA序列全長約1856 bp，開放閱讀框996 bp，編碼331個氨基酸，5’非翻譯區334 bp，3’非翻譯區526 bp，前體蛋白預測相對分子質量38.7kDa，等電點9.09。

神經肽FMRFamide生殖調控劑的制備方法包括總RNA提取、cDNA第一鏈的合成、虎斑烏賊FMRFamide基因核心序列片段的簡并引物合成、虎斑烏賊FMRFamide核心序列的擴增、RACE獲得FMRFamide基因cDNA的全長和序列信息分析。

總RNA提取：在虎斑烏賊腦組織中加入質量體積比為0.05~0.07mg：1μL Trizol，勻漿，補加等體積的Trizol，輕輕搖晃后靜置；加入氯仿，劇烈震蕩后靜置，高速離心，取最上層的上清液；加入異丙醇搖勻，靜置，離心，除去上清液，保留沉淀；加入70~80%的乙醇，用槍頭吹吸沉淀，高速離心，用槍頭吸除液體部分，保留沉淀；室溫靜置15~25分鐘待RNA呈半干的透明狀態，用DEPC水溶解后，得到虎斑烏賊總RNA液。

cDNA第一鏈的合成為：將虎斑烏賊總RNA液點樣到1%的瓊脂糖凝膠上跑膠，并在UVP紫外凝膠成像儀中呈像，進一步經紫外分光光度計測定其A260/A280值在1.8-2.0之間，可作為模板進一步用于cDNA第一鏈合成；使用Takara公司生產的M-MLV（Rnase H^-）反轉錄試劑盒，利用虎斑烏賊腦組織提取的總RNA進行cDNA第一條鏈合成實驗。

虎斑烏賊FMRFamide基因核心序列片段的簡并引物合成：將合成的cDNA置于-30~-15℃保存備用；根據NCBI數據庫中獲得已報道的軟體動物物種FMRFamide基因序列，通過分析氨基酸序列的保守區，合成了多對用來克隆虎斑烏賊FMRFamide基因核心序列片段的簡并引物：FMRF-F：GCTGAAGATGAACTGGAAGAG；FMRF-R：CAAAWAACTGAATGWCGCAGG；FMRF-5'outer：GATGTCTCTAGCTTGCTTCC；FMRF-5'inner：GATGGAGCCGCACACACAGAC；FMRF-3'outer：GAAACCCTGAGGACCAAGAAGCTGACAA；FMRF-3'inner：GGCGGTGAAGACGATGACGTGAACT；M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC；5’RACEAdapter ：GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG；5’RACEOuterPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA；5’RACEInnerPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGA；3’RACEAdapter ：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；3’RACEOuterPrimer：GCGGATCCGAATTAATACGACT；3’RACEInnerPrimer：GCGAGCACAGAATTAATACGACT。