[發(fā)明專利]miR?199a?5p的模擬物、抑制物及其重組表達(dá)載體與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711062731.9
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107841503A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐存拴;孟竺;張春艷
• 申請（專利權(quán)）人: 河南師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K48/00;A61K31/7088;A61P1/16
• 代理公司: 北京易正達(dá)專利代理有限公司11518
• 代理人: 趙白

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種miR-199a-5p的模擬物和一種抑制物及后者的重組表達(dá)載體及其用途。

背景技術(shù)

肝臟是機(jī)體的重要器官，具有儲存、代謝、生物轉(zhuǎn)化、解毒、造血、合成膽色素、分泌、再生等功能。研究肝再生相關(guān)基因?qū)Ω渭?xì)胞增殖和肝再生的作用，對揭示肝再生機(jī)制、構(gòu)建人工肝、建立治療和預(yù)防肝病方法等都有重要理論意義和應(yīng)用價值。

microRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，到目前為止，在動植物以及病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有28645個miRNA分子。miRNA通過與靶基因mRNA的3′-UTR特定區(qū)域的結(jié)合引起翻譯的抑制或是mRNA的降解。由于miRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡等一系列的重要活動，且在許多疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用，因此，越來越多地受到研究人員的高度重視miRNA研究。

研究表明，miR-199a-5p出現(xiàn)于多種生物，能調(diào)節(jié)TNF-α、VEGFA、mTOR、MMP9、CD44、HIF-1α等多個靶基因的表達(dá)。其中TNF-α是由巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，以三聚體的形式發(fā)揮作用。TNF三聚體結(jié)合到TNF-R₁的胞外區(qū)后，TNF-R₁胞內(nèi)區(qū)上的SODD(silencer of death domain)被釋放。隨后，TRADD(TNF-R₁ associated death domain protein)的C端死亡結(jié)構(gòu)域與TNF-R₁的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成TNRR_l/TRADD復(fù)合體。FADD(Fas associated death domain protein)被招募到該復(fù)合體上，F(xiàn)ADD的N端MORT結(jié)構(gòu)域進(jìn)而激活MACH/FLICE(Caspase-8)，被激活的Caspase-8再去激活其他的ICE/CED3蛋白酶。這樣，通過caspasse-8蛋白酶的級聯(lián)放大反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

miR-199a-5p的模擬物體內(nèi)促細(xì)胞增殖的原理是用基因轉(zhuǎn)染的方法將模擬物導(dǎo)入受體細(xì)胞，該模擬物與TNF-α的3′-UTR結(jié)合，導(dǎo)致TNF-α表達(dá)水平降低，從而阻遏TNF-α的促凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖；miR-199a-5p的抑制物體內(nèi)發(fā)揮作用的原理是設(shè)計并構(gòu)建重組載體，其內(nèi)含有miR-199a-5p的抑制物核苷酸序列，用基因轉(zhuǎn)移的方法將重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，通過載體過表達(dá)miR-199a-5p的抑制物核苷酸序列，此抑制物核苷酸序列與miR-199a-5p定點(diǎn)結(jié)合，從而抑制miR-199a-5p與TNF-α的3′-UTR結(jié)合，TNF-α表達(dá)水平增加，從而促進(jìn)TNF-α的促細(xì)胞凋亡作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種miR-199a-5p的模擬物及抑制物，該模擬物及抑制物可用于調(diào)節(jié)TNF-α蛋白表達(dá)，以及調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖或凋亡的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究，有利于為開發(fā)相關(guān)藥物提供高效的、大通量的篩選和評價平臺及手段，將大大促進(jìn)miRNA在腫瘤預(yù)防、診斷和治療中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種miR-199a-5p的模擬物，所述模擬物為SEQ ID NO.1。

本發(fā)明還提供了一種能抑制miR-199a-5p結(jié)合TNF-α的3′-UTR的抑制物，其特征在于，所述抑制物選自TNF-α的3′-UTR中長約700～1000bp區(qū)段；所述抑制物與miR-199a-5p的結(jié)合位點(diǎn)為CACTGGA。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述抑制物為SEQ ID NO.2。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述抑制物核苷酸序列的5′和3′末端分別添加限制性酶切位點(diǎn)；優(yōu)選地，所述限制性酶切位點(diǎn)在酶切后產(chǎn)生粘性末端；更優(yōu)選地，所述的限制性酶切位點(diǎn)分別為Xho I和Not I對應(yīng)的核苷酸序列；所述Xho I酶切位點(diǎn)位于5′末端，所述Not I酶切位點(diǎn)位于3′末端。

本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述的能抑制miR-199a-5p結(jié)合TNF-α的3′-UTR的抑制物。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述重組表達(dá)載體中的標(biāo)記基因?yàn)殡p熒光素報告酶。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述重組表達(dá)載體是通過將上述的能抑制miR-199a-5p結(jié)合TNF-α的3′-UTR的抑制物連接到報告載體psi-CHECK-2中得到的。