[發明專利]一種用于檢測寨卡病毒的引物組、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201711060510.8
• 申請日: 2017-11-01
• 公開（公告）號: CN107574265A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發明（設計）人: 張薇;夏雪山;王耕;宋玉竹;王振超;馮悅
• 申請（專利權）人: 張薇
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 北京細軟智谷知識產權代理有限責任公司11471
• 代理人: 王金寶

1.一種用于檢測寨卡病毒的引物組，其特征在于，包括引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6，所述引物P1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物P2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物P3的序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物P4的序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物P5的序列如SEQ ID NO：5所示，所述引物P6的序列如SEQ ID NO：6所示。

2.一種含有權利要求1所述的引物組的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含所述引物組和反應液，所述反應液包括反應濃縮液和逆轉錄酶；所述反應濃縮液包括DNA聚合酶，緩沖液，dNTP，MgSO₄，甜菜堿和熒光染料。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括對照物，所述對照物包括陽性對照物和陰性對照物。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照物為含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：7所示；所述陰性對照物為不含目的基因的反應液。

5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述引物P1和引物P2的濃度為40nM，引物P3和引物P4的濃度為5nM、引物P5和引物P6的濃度為20nM。

6.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述引物組的體積為6ul，所述反應濃縮液的體積為15ul，逆轉錄酶的體積為1ul。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述引物組中各引物的體積均為1ul。

8.一種使用權利要求1所述的引物組的寨卡病毒檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括以下步驟：

A、提取RNA：提取樣本中的RNA；

B、引物處理：將引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6稀釋后，混合均勻；

C、環介導等溫擴增反應：將樣品、引物試劑和反應液混合均勻后，放入等溫擴增熒光檢測系統，進行環介導等溫擴增反應；所述反應液包括反應濃縮液和逆轉錄酶；所述反應濃縮液包括DNA聚合酶，緩沖液，dNTP，MgSO₄，甜菜堿和熒光染料；

D、檢測：在環介導等溫擴增反應過程中，對cDNA的濃度進行分析，得到擴增曲線和溶解曲線；

E、結果判斷：根據所獲得擴增曲線和溶解曲線判定，若擴增曲線為明顯的S型曲線，以及溶解曲線峰型單一且較為尖銳，則判定為陽性結果；擴增曲線沒有出現明顯S型曲線，則判定為陰性結果；擴增曲線有明顯S型曲線，但溶解曲線峰型不單一，則判定為非特異性擴增。

9.根據權利要求8所述的寨卡病毒檢測方法，其特征在于，步驟B中，稀釋后，所述引物P1和引物P2的濃度為40nM，引物P3和引物P4的濃度為5nM、引物P5和引物P6的濃度為20nM；步驟C中，所述引物組中各引物的體積均為1ul，所述反應濃縮液的體積為15ul，逆轉錄酶的體積為1ul，樣品的體積為3ul；使用定量PCR儀設置65℃、30s/循環，60個循環，循環完成后進行溶解曲線分析或使用恒溫熒光PCR儀，設置為65℃，30分鐘，進行溶解曲線分析。

10.根據權利要求9所述的寨卡病毒檢測方法，其特征在于，步驟C中，設置陽性對照組和陰性對照組，當陽性對照組的檢測結果是陽性結果，陰性對照組的檢測結果時陰性結果時，則說明實驗有效，否則實驗無效；所述陽性對照物為含目的基因的大腸桿菌質粒DNA，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：7所示；所述陰性對照物為不含目的基因的反應液。