[發(fā)明專利]一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法及所獲得的長單鏈DNA

有效

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• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107988324B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發(fā)明（設計）人: 張文科;劉建宇
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法及所獲得的長單鏈DNA，屬于DNA合成技術領域，解決了現(xiàn)有長單鏈DNA的合成方法存在的成本高、成功率低、無法在單鏈DNA兩端選擇性修飾的問題。本發(fā)明的一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法，包括以下步驟：第一次滾環(huán)擴增反應：采用phi29 DNA聚合酶、帶有官能團X的短鏈引物和環(huán)狀模板合成一端帶有官能團X的單鏈DNA；第二次滾環(huán)擴增反應：將上述獲得的單鏈DNA作為引物，采用Therminator DNA聚合酶和帶有官能團Y的dN*TPs合成雙端帶有官能團的長單鏈DNA。本發(fā)明的合成方法適用于合成長度能夠達到500個堿基以上的、只在雙端帶有修飾基團的單鏈DNA。

技術領域

本發(fā)明屬于DNA合成技術領域，具體涉及一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法及所獲得的長單鏈DNA。

背景技術

核酸的單分子研究具有重要生物學意義，是目前研究熱點之一。對單鏈DNA末端進行選擇性修飾，是開展核酸的高級結構及功能的單分子研究的關鍵。

目前，對于較長的單鏈DNA單分子研究，原料主要來源于從雙鏈熔融裂解成單鏈得到，操作繁瑣；而從工廠高價購買的單鏈DNA長度限制于300nt以下，且堿基數(shù)越多，造價越高，合成失敗率越高。

現(xiàn)有合成較長的單鏈DNA(長度在500堿基以上)的方法主要為RCA技術，即滾環(huán)擴增技術(rolling circle amplification)，然而傳統(tǒng)RCA技術制備的單鏈DNA只有5′端能夠含有修飾基團。同時，利用特別的酶RCA技術可以引入帶有官能團修飾的核苷酸dN*TPs到單鏈DNA，然而通過這種方法合成的單鏈DNA官能團位點隨機分布，不能夠實現(xiàn)在單鏈DNA兩端的選擇性修飾，也就不能夠實現(xiàn)單鏈DNA的選擇性固定。

發(fā)明內容

為了解決現(xiàn)有長單鏈DNA的合成方法存在的成本高、成功率低、無法在單鏈DNA兩端選擇性修飾的問題，本發(fā)明提供一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法及所獲得的長單鏈DNA。

本發(fā)明為解決技術問題所采用的技術方案如下：

本發(fā)明的一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法，包括以下步驟：

步驟一、第一次滾環(huán)擴增反應

采用phi29DNA聚合酶、帶有官能團X的短鏈引物和環(huán)狀模板合成一端帶有官能團X的單鏈DNA；

步驟二、第二次滾環(huán)擴增反應

將上述獲得的單鏈DNA作為引物，采用Therminator DNA聚合酶和帶有官能團Y的dN*TPs合成雙端帶有官能團的長單鏈DNA。

作為優(yōu)選的實施方式，所述官能團X為：6-FAM、Acrydite、Alexa Fluor 488、AMCA、Azide(N3)、BHQ1、BHQ2、Biotin、Biotin-TEG、C3Spacer、CHCH、CHO、COOH、Cy3、Cy5、CY5.5、Dabcyl、DBCO、Desthio Biotin、Desthio Biotin-TEG、Dig、Dithiol、5`Dual Biotin、Ferrocene、HEX、HS-SH C6、JOE、Methylene Blue、NH2 C12、NH2 C6、P、Pyrene、Quasar 670、ROX、SH C6、Spacer 18、TAMRA、TET、Texas Red、triple Biotin或triple SH。

作為優(yōu)選的實施方式，所述短鏈引物的序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

作為優(yōu)選的實施方式，所述環(huán)狀模板的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

作為優(yōu)選的實施方式，所述官能團Y為：Biotin、Fluorescein、Texas Red、Aminoallyl或Alexa Fluor。