[發明專利]一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法及所獲得的長單鏈DNA

有效

• 申請號: 201711060477.9
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107988324B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 張文科;劉建宇
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產權代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

1.一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、第一次滾環擴增反應

采用phi29 DNA聚合酶、帶有X的短鏈引物和環狀模板合成一端帶有X的單鏈DNA；

所述X為：6-FAM、Acrydite、Alexa Fluor 488、AMCA、N₃、BHQ1、BHQ2、Biotin、Biotin-TEG、C3 Spacer、CHCH、CHO、COOH、Cy3、Cy5、CY5.5、Dabcyl、DBCO、Desthio Biotin、DesthioBiotin-TEG、Dithiol、Dual Biotin、Ferrocene、HEX、JOE、Methylene Blue、NH₂ C12、NH₂C6、P、Pyrene、Quasar 670、ROX、SH C6、Spacer 18、TAMRA、TET、Texas Red、triple Biotin或triple SH；

所述步驟一的具體反應過程如下：

將去離子水4.5μL，終濃度為1X的phi29 DNA聚合酶反應緩沖液1μL，終濃度為25μM的短鏈引物2.5μL，終濃度為0.1μg/mL的環狀模板1μL在95℃條件下加熱3min，0℃條件下冷卻15min；

向上述所得產物中加入終濃度為0.5mM的each dNTPs 0.5μL和終濃度為0.5U/μL的phi29 DNA聚合酶0.5μL，30℃孵育3～12 h，使用GenElute? PCR回收試劑盒回收單鏈DNA產物；

步驟二、第二次滾環擴增反應

將步驟一回收獲得的單鏈DNA作為引物，采用Therminator DNA聚合酶、帶有Y的dN*TPs和環狀模板合成只在雙端帶有官能團的長單鏈DNA；

所述Y為biotin；

所述步驟二的具體反應過程如下：

將終濃度為10μg/mL的單鏈DNA產物4μL，終濃度為1X的Therminator DNA聚合酶反應緩沖液1μL，終濃度為0.1μg/mL的環狀模板2μL在95℃條件下加熱3min，0℃條件下冷卻15min；

向上述所得產物中加入終濃度為0.2mM含有dUTP-biotin的each dN*TPs 2μL和終濃度為2U/μL的Therminator DNA聚合酶1μL，75℃孵育過夜，使用GenElute? PCR回收試劑盒回收長單鏈DNA產物。

2.根據權利要求1所述的一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法，其特征在于，所述短鏈引物的序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

3.根據權利要求1所述的一種合成雙端修飾的長單鏈DNA的方法，其特征在于，所述環狀模板的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。