[發明專利]用于檢測EGFR基因2312-2313位突變的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201711060381.2
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN109722478A
• 公開（公告）日: 2019-05-07
• 發明（設計）人: 莫敏俐;丁鳳;陳釗;李暉
• 申請（專利權）人: 嘉興雅康博醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種用于檢測EGFR基因2312?2313位突變的引物、探針及試劑盒。所述引物如SEQ ID No.1?SEQ ID No.2所示，所述探針如SEQ ID No.3所示。利用本發明的試劑盒進行實時熒光PCR，可以檢測EGFR基因2312?2313位插入ACCCCA堿基突變。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種用于檢測EGFR基因突變的引物、探針及相關試劑盒。

背景技術

惡性腫瘤在中國發病率近年來呈逐年上升趨勢，每年新增患者達170萬人以上。肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其中80％～85％為非小細胞肺癌(nonsmall celllungcancer，NSCLC)。在我國，肺癌已成為惡性腫瘤第一位死因，5年生存率約15％。隨著腫瘤分子生物學的發展，靶向治療倍受關注，選擇合適的患者進行靶向治療是其成功的關鍵，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是目前腫瘤治療的重要靶點。

EGFR基因位于人第7號染色體短臂(7p12)，長約118kb，由28個外顯子組成。其轉錄形成的mRNA長約5.6kb，編碼分子量為170kD的跨細胞膜糖蛋白，胞內區具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)活性，負責將胞外信號傳遞至胞內。異常的EGFR活化能夠促進腫瘤細胞的增殖、遷移、分化、血管新生，并且能夠抑制腫瘤細胞的凋亡。

EGFR基因突變主要發生在胞內TK區域的前4個外顯子上(18～21外顯子)，研究表明：EGFR基因18、19、21外顯子發生突變的肺癌患者服用酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinase inhibitors，TKIs)類藥物的療效較好，20外顯子發生的突變常與TKIs耐藥有關^[1-4]。中國肺癌患者中，EGFR的突變率約為30％～50％，其中18外顯子上發生的點突變約占EGFR突變類型的5％左右，19外顯子上發生的多種缺失突變約占EGFR突變類型的45％左右，21外顯子上發生的L858R、L861Q點突變約占EGFR突變類型的40％～45％，20外顯子上發生的T790M點突變約占EGFR突變類型的5％左右[5-6]。

目前Sanger測序法是EGFR基因突變檢測的主要方法。然而，該方法的靈敏度低，會導致漏檢及假陰性的發生，而且檢測時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。臨床上迫切需要開發一種高靈敏度、快速的EGFR基因突變檢測技術。

本發明的發明人在胃腸道間質瘤(GIST)的日常檢測中發現了與胃腸道間質瘤有關的位于EGFR基因的新突變位點，即2312-2313位插入突變。本發明的發明人針對該突變開發了一種快速、高靈敏、操作簡便的檢測試劑盒及相關的檢測方法，可以用于GIST化療預后。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種用于檢測EGFR基因突變的引物和探針，所述突變是2312-2313位插入ACCCCA(堿基突變：2312-2313insACCCCA，蛋白突變：N771＞KPH)。本發明的引物與探針包括如下序列：

正向引物(F)：GACAAACCCC ACCCCCA(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：GGACATAGTC CAGGAGGCA(SEQ ID No：2)

探針(PB)：TGGGCATCTG CCTCACCTCC A(SEQ ID No：3)

本發明另一方面提供一種用于檢測EGFR基因2312-2313位突變的檢測試劑盒，所述試劑盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示的引物和SEQ ID No.3所示的探針。

根據所采用的PCR方法，本發明的試劑盒還可以包括內參基因和內控基因。

本發明另一方面提供一種獲得與EGFR基因2312-2313位突變有關的Ct值的方法，其包括以下步驟：