[發明專利]一種耐熱型長雙歧桿菌及其篩選方法和菌粉制備方法

在審

• 申請號: 201711060084.8
• 申請日: 2017-11-01
• 公開（公告）號: CN107603919A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發明（設計）人: 方曙光;陳珂可;馮勝鵬;姜甜;朱建國
• 申請（專利權）人: 江蘇微康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京易捷勝知識產權代理事務所(普通合伙)11613
• 代理人: 齊勝杰

技術領域

本發明涉及益生菌領域，尤其涉及一種耐熱型長雙歧桿菌及其篩選方法和菌粉制備方法。

背景技術

長雙歧桿菌，屬于可用于食品中添加的益生菌，主要涉及食品、保健品、日化用品、飼料等產品的應用。益生菌菌粉，尤其通常作為乳酸菌相關的益生菌菌粉在大部分益生菌發酵食品、保健品制劑、生物飼料、醫藥制劑中所常見的。

益生菌普遍對環境要求較高，對外界耐受性較差，在常溫下的長期貯存一直難以保持高活性，使得在產品開發和應用方面具有局限性。目前市場上益生菌雖然以凍干菌粉形式進行供應，但是在微生態制劑產品中普遍出現貨架期內儲存穩定性嚴重下降趨勢，特別是常溫或外環境溫度較高的非恒溫貯存產品，容易出現短期內活菌數大幅度下滑或驟降等現象。

目前國內產品微生態制劑產品大多處于常溫或室溫保存，個別地區或存在局部時段溫度過高或長期惡劣氣候，無法對產品放置條件達到保證，或者在一些需要特殊工藝的產品中需要經過高溫長時處理，比如在膠囊、軟糖、巧克力等產品制造過程中對產品中活菌造成巨大損失，所以需要一種能提高菌株自身耐受性的篩選方法所獲得原料來應對不同產品的開發及應用。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種具有高活性、在常溫或高溫貨架期內能顯著提高穩定性、并且在人體胃腸道中具有良好的耐酸、耐膽鹽及胃腸道粘附性的耐熱型長雙歧桿菌及其篩選方法和菌粉制備方法。

本發明第一方面提供一種耐熱型長雙歧桿菌，已于2015年1月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.10452，分類命名為長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum)，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。

具體的，所述耐熱型長雙歧桿菌在75℃條件下保溫30分鐘存活率可達到50％以上。

具體的，所述耐熱型長雙歧桿菌在體外模擬胃酸pH 2.5環境條件下1-2小時內存活率為60-80％。

具體的，所述耐熱型長雙歧桿菌在體外模擬膽鹽高滲透0.3％環境條件下1-2小時內存活率為50-75％。

本發明第二方面提供一種耐熱型長雙歧桿菌的篩選方法，包括以下步驟：

S1、樣品采集；

S2、條件性初步篩選：樣品混合均勻梯度稀釋后，移液至篩選培養基上涂布分離，厭氧恒溫25-45℃培養12-72小時；然后挑選邊緣光滑、呈乳白色隆起的菌落，反復劃線鏡檢出菌體呈桿狀、一端有時呈分叉狀的革蘭氏陽性菌落，反復純化后繼續厭氧恒溫25-45℃培養12-72小時；

S3、抗逆性復篩：將菌泥加入稀釋液混合均勻，然后置于40-80℃恒溫水浴鍋進行熱激，計時熱激5-30分鐘，完成熱激后迅速使用冷卻水降溫于20℃以下，將熱激后含菌稀釋液進行涂布或劃線進行分離，挑選其中生長飽滿且大小適中菌落于MRS培養基中擴培，重復將擴培后的發酵液進行離心、稀釋、熱激、涂布、篩選一系列循環，循環次數30-50次，通過檢測其熱激前后細胞存活率達到20-40％以上可完成條件初篩，得到耐熱型長雙歧桿菌，隨后進行保藏。

多次高溫循環熱激條件下進行耐熱型菌株的篩選，主要目的是：通過外界亞致死條件，刺激細胞產生熱激蛋白，激發菌體自身的非特異性免疫，不斷循環篩選，挑選出具有在熱激條件下表現出高抗逆性特性的菌株。通過外界的亞致死脅迫，導致菌體趨于抗性的提升，并且保證菌株復蘇過程中擁有較高活性。

最優的，步驟S3中，將菌泥加入稀釋液混合均勻，然后置于55℃恒溫水浴鍋進行熱激；在該溫度將造成細胞亞致死，脅迫細胞在接近致死的條件下刺激產生熱激蛋白形成非特異性免疫，進一步篩選具有此能力特性菌株。

最優的，步驟S3中，計時熱激15-20分鐘；考慮到物料中心溫度與邊緣溫度的差異，以及混合體系介質傳熱速率等關系設計。最優的，控制物料中心溫度達到指定溫度后，恒溫保存15min。該條件下可防止體系內還原糖與蛋白類成分發生過度非酶褐變反應，造成抑制性產物影響實驗設計條件。

具體的，所述樣品采集自健康成年人體糞便，傳統發酵食品，比如酸牛奶、酸羊奶、奶酪等，以及少數哺乳動物腸道上皮細胞。

具體的，步驟S2中，樣品置于生理鹽水中混合均勻梯度稀釋。