[發(fā)明專利]一種耐熱型長雙歧桿菌及其篩選方法和菌粉制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711060084.8
• 申請(qǐng)日: 2017-11-01
• 公開（公告）號(hào): CN107603919A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方曙光;陳珂可;馮勝鵬;姜甜;朱建國
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇微康生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京易捷勝知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11613
• 代理人: 齊勝杰

1.一種耐熱型長雙歧桿菌，其特征在于：所述耐熱型長雙歧桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.10452。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐熱型長雙歧桿菌，其特征在于：所述耐熱型長雙歧桿菌在75℃條件下保溫30分鐘存活率可達(dá)到50％以上。

3.根據(jù)權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的耐熱型長雙歧桿菌的篩選方法，其特征在于：

S1、樣品采集；

S2、條件性初步篩選：樣品混合均勻梯度稀釋后，移液至篩選培養(yǎng)基上涂布分離，厭氧恒溫25-45℃培養(yǎng)12-72小時(shí)；然后挑選邊緣光滑、呈乳白色隆起的菌落，反復(fù)劃線鏡檢出菌體呈桿狀、一端有時(shí)呈分叉狀的革蘭氏陽性菌落，反復(fù)純化后繼續(xù)厭氧恒溫25-45℃培養(yǎng)12-72小時(shí)；

S3、抗逆性復(fù)篩：將菌泥加入稀釋液混合均勻，然后置于40-80℃恒溫水浴鍋進(jìn)行熱激，計(jì)時(shí)熱激5-30分鐘，完成熱激后迅速使用冷卻水降溫于20℃以下，將熱激后含菌稀釋液進(jìn)行涂布或劃線進(jìn)行分離，挑選其中生長飽滿且大小適中菌落于MRS培養(yǎng)基中擴(kuò)培，重復(fù)將擴(kuò)培后的發(fā)酵液進(jìn)行離心、稀釋、熱激、涂布、篩選一系列循環(huán)，循環(huán)次數(shù)30-50次，通過檢測其熱激前后細(xì)胞存活率達(dá)到20-40％以上可完成條件初篩，得到耐熱型長雙歧桿菌，隨后進(jìn)行保藏。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耐熱型長雙歧桿菌的篩選方法，其特征在于：所述樣品采集自健康成年人體糞便。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耐熱型長雙歧桿菌的篩選方法，其特征在于：步驟S2中，樣品置于生理鹽水中混合均勻梯度稀釋。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耐熱型長雙歧桿菌的篩選方法，其特征在于：步驟S2中，所述篩選培養(yǎng)基包括10-20g/L的葡萄糖、5-20g/L的蛋白胨、10-20g/L的酵母浸膏、3-5g/L的無水乙酸鈉、1-3g/L的磷酸氫二鉀、1-3g/L的檸檬酸氫二銨、5ml/L的莫匹羅星鋰鹽，調(diào)節(jié)pH至6.8。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耐熱型長雙歧桿菌的篩選方法，其特征在于：步驟S3中，所述稀釋液以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)包括0.05-0.1％的氯化鈉、0.005-0.01％的酪蛋白胨、0.4-0.8％的磷酸氫二鈉、0.2-0.4％的磷酸二氫鉀。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的耐熱型長雙歧桿菌的篩選方法，其特征在于：步驟S3中，所述擴(kuò)培中菌株的接種量為體積百分比1-10％，培養(yǎng)溫度為25-45℃，培養(yǎng)時(shí)間為12-72小時(shí)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的耐熱型長雙歧桿菌菌粉的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1、菌株活化及擴(kuò)培：將菌株于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，厭氧擴(kuò)培；

S2、厭氧發(fā)酵：將菌株接種于MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵，控制pH 5.5-6.5，發(fā)酵時(shí)間6-15小時(shí)，OD600達(dá)到6.0-12.0后降溫；

S3、菌體收集及乳化：將發(fā)酵液離心后傾倒上清液，收集菌體后與保護(hù)劑按比例混合均勻后乳化；

S4、將乳化液凍干；

S5、粉碎后包裝。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的耐熱型長雙歧桿菌菌粉的制備方法，其特征在于：步驟S3中，將發(fā)酵液通過5000-15000rpm，20-30分鐘離心后傾倒上清液，收集菌體，將菌泥與保護(hù)劑按照1:1.5-3.0比例進(jìn)行配比，混合均勻后使用乳化器1000-5000rpm，乳化10-25分鐘，充分混合后完成乳化。