[發明專利]海馬神經干細胞、神經元分離培養方法

在審

• 申請號: 201711058543.9
• 申請日: 2017-11-01
• 公開（公告）號: CN107574151A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發明（設計）人: 馮世慶;魏志堅;劉洋;周新福;姚雪;周先虎;寧廣智;史仲舉;樊保佑;丁漢
• 申請（專利權）人: 馮世慶
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12N5/0793
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司11616
• 代理人: 張蕾

技術領域

本發明涉及神經細胞培養領域，尤其是涉及一種海馬神經干細胞、神經元分離培養方法。

背景技術

神經細胞培養是研究神經科學的基本技術，尤其是原代細胞培養，對無菌技術/分離技術等非常嚴格，由于神經元的不可增殖性(終末分化細胞)，使得神經元的體外培養需要消耗大量的實驗動物。神經干細胞是當前神經科學研究的另一熱點，神經干細胞的取材多來源于新生鼠或胚胎，由于神經干細胞培育條件的特殊性(無血清培養，否則將會分化)，使得一個實驗動物往往只能單純用于神經干細胞的提取，造成極大的浪費。

發明內容

本發明的目的在于：針對現有技術存在的問題，提供一種海馬神經干細胞、神經元分離培養方法，解決現有神經細胞培養方法會造成極大浪費的問題。

本發明的發明目的通過以下技術方案來實現：

一種海馬神經干細胞、神經元分離培養方法，該方法包括：

先用多聚賴氨酸鋪板，結束后用雙蒸水沖洗，再自然晾干；

處死出生當天或第一天的小鼠，用酒精噴灑小鼠，將小鼠大腦收集于盛有培養液+青霉素/鏈霉素溶液的離心管中，置于冰上；

在顯微鏡下去除腦膜，分離完整的海馬組織，將收集好的組織轉移至盛有培養液+青霉素/鏈霉素溶液的離心管中，置于冰上；

進行離心，棄掉上清，加入胰蛋白酶進行消化；

離心結束，加胎牛血清中止消化；用經拋光處理的玻璃移液管進行吹打；

離心，棄掉上清，加入神經干細胞培養基重懸組織并吹勻；

將重懸液經濾器過濾；

對過濾后液體進行細胞計數，種板；

種板后，吸出神經干細胞培養基轉移至培養瓶；

孔板中換成神經元培養基。

優選的，提前2h用50ug/ml多聚賴氨酸鋪板，結束后雙蒸水沖洗3次，自然晾干。

優選的，處死出生當天或第一天的小鼠，用70％酒精噴灑小鼠，將小鼠大腦收集于盛有培養液+2％青霉素/鏈霉素溶液的50ml離心管中，置于冰上。

優選的，在顯微鏡下去除腦膜，分離完整的海馬組織，將收集好的組織轉移至盛有培養液+2％青霉素/鏈霉素溶液的15ml離心管中，置于冰上。

優選的，600～800rpm x 4～6min離心，棄掉上清，加入0.05％胰蛋白酶消化7min，溫度為37℃。

優選的，離心結束，加10％胎牛血清中止消化；用經拋光處理的玻璃移液管吹打10-15次。

優選的，600～800rpm x 4～6min離心，棄掉上清，加入2ml神經干細胞培養基重懸組織并吹勻。

優選的，將2ml重懸液經70um濾器過濾。

優選的，種板24h后，吸出神經干細胞培養基轉移至T25培養瓶，每3天半換液。

優選的，孔板中換成神經元培養基，每3天半換液。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

1、可在處死一次動物基礎上同時完成穩定的神經干細胞和神經元培養，節約實驗動物。

2、能夠培養密度及形態均較好的神經元，可用于神經元的相關體外實驗體系構建。

3、培養出的神經干細胞增殖性良好，傳代穩定，分化潛能保持較好。

附圖說明

圖1為神經元培養第1天的形態圖；

圖2為神經元培養第3天的形態圖；

圖3為神經元培養第4天的形態圖；

圖4為神經干細胞培養第1天的形態圖；

圖5為神經干細胞培養第3天的形態圖；

圖6為神經干細胞形成的神經球細胞核染色圖；

圖7為神經干細胞形成的神經球表達神經干細胞特異性標記Nestin染色圖；

圖8為神經干細胞形成的神經球中向神經元方向分化表達神經元特異性標志物Tuj-1染色圖；

圖9為神經干細胞形成的神經球3種染色合并的圖片；

圖10為是神經元細胞核染色圖；

圖11為神經元特異性標志物Tuj-1染色圖；

圖12為神經元2種染色合并的圖片。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。

實施例1

本實施例提供一種海馬神經干細胞、神經元分離培養方法，該方法使用改良新生鼠神經培育流程，使用改良培養基，對新生鼠海馬組織進行原代培養，并可直接制作細胞爬片，24小時后提取細胞培養上清轉移至另一培養體系可直接進行神經干細胞培養，原體系內貼壁細胞更換改良神經元培養基可進行神經元培養。本發明具體步驟如下：