[發(fā)明專利]海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711058543.9
• 申請日: 2017-11-01
• 公開（公告）號: CN107574151A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮世慶;魏志堅;劉洋;周新福;姚雪;周先虎;寧廣智;史仲舉;樊保佑;丁漢
• 申請（專利權(quán)）人: 馮世慶
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12N5/0793
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11616
• 代理人: 張蕾

1.一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括：

先用多聚賴氨酸鋪板，結(jié)束后用雙蒸水沖洗，再自然晾干；

處死出生當(dāng)天或第一天的小鼠，用酒精噴灑小鼠，將小鼠大腦收集于盛有培養(yǎng)液+青霉素/鏈霉素溶液的離心管中，置于冰上；

在顯微鏡下去除腦膜，分離完整的海馬組織，將收集好的組織轉(zhuǎn)移至盛有培養(yǎng)液+青霉素/鏈霉素溶液的離心管中，置于冰上；

進行離心，棄掉上清，加入胰蛋白酶進行消化；

離心結(jié)束，加胎牛血清中止消化；用經(jīng)拋光處理的玻璃移液管進行吹打；

離心，棄掉上清，加入神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基重懸組織并吹勻；

將重懸液經(jīng)濾器過濾；

對過濾后液體進行細胞計數(shù)，種板；

種板后，吸出神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶；

孔板中換成神經(jīng)元培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，提前2h用50ug/ml多聚賴氨酸鋪板，結(jié)束后雙蒸水沖洗3次，自然晾干。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，處死出生當(dāng)天或第一天的小鼠，用70％酒精噴灑小鼠，將小鼠大腦收集于盛有培養(yǎng)液+2％青霉素/鏈霉素溶液的50ml離心管中，置于冰上。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，在顯微鏡下去除腦膜，分離完整的海馬組織，將收集好的組織轉(zhuǎn)移至盛有培養(yǎng)液+2％青霉素/鏈霉素溶液的15ml離心管中，置于冰上。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，600～800rpm x 4～6min離心，棄掉上清，加入0.05％胰蛋白酶消化7min，溫度為37℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，離心結(jié)束，加10％胎牛血清中止消化；用經(jīng)拋光處理的玻璃移液管吹打10-15次。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，600～800rpm x 4～6min離心，棄掉上清，加入2ml神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基重懸組織并吹勻。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，將2ml重懸液經(jīng)70um濾器過濾。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，種板24h后，吸出神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶，每3天半換液。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海馬神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元分離培養(yǎng)方法，其特征在于，孔板中換成神經(jīng)元培養(yǎng)基，每3天半換液。