[發(fā)明專利]偽狂犬病毒抗體快速定量檢測卡及使用方法

在審

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• 申請日: 2017-11-01
• 公開（公告）號: CN107860921A
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發(fā)明（設計）人: 吳俊清;章健;吳冠英;王澤洲
• 申請（專利權）人: 杭州微瑞科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及一種檢測卡及使用，特別是涉及一種豬血清中偽狂犬病毒抗體快速定量檢測卡及使用方法。

背景技術

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種高度接觸性傳染病。PRV是雙鏈DNA病毒，屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科，皰疹病毒I型。其完整病毒粒子為圓形，直徑150～180 nm，核衣殼直徑為105～110nm。有囊膜，囊膜表面有長約8～10 nm呈放射狀排列的纖突。

病毒基因組由長獨特區(qū)(Unique long region，UL)、短獨特區(qū)(Unique short region，US)以及位于US兩側的末端重復序列(Wetminal repeat，TR)與內部重復序列(Internal repeat，IR)組成。對PRV基因組序列測定發(fā)現其由72個閱讀框組成，可編碼70種蛋白，目前已發(fā)現和命名的有gB、gC、gD、gE、gG、gH、gl、gK、gL、gM、gN 11種糖蛋白。編碼gC、gE、gG、gI、gM和gN的基因為病毒復制非必需的，gB、gC、gD、gE和gI與病毒的毒力有關。此外，胸苷激酶(Thymidine kinase，TK)、核苷酸還原酶(Ribonucleotide reduetase，RR)、蛋白激酶(Protein kinase，PK)、堿性核酸外切酶(Alkaline exonuclease，AN)和脫氧尿苷三磷酸激酶(Deoxyuridine triphosphokinase，dUTPase)等幾種酶也與病毒的毒力密切相關，其中TK是PRV最主要的毒力基因。糖蛋白gB、gC、gD在免疫誘導方面最為重要。目前已經發(fā)現PRV有11種糖蛋白， 其中，gB、 gC、gD均為刺激機體產生中和抗體的蛋白，所產生的抗體無論是在體內、體外，還是在有無補體存在的情況下都有中和PRV 的能力，因此，gB、gC、gD 是研制PRV亞單位疫苗的首選糖蛋白。本病毒可在豬腎細胞、兔腎細胞、牛睪丸細胞、雞胚成纖維等原代細胞以及PK-15、BHK-21等傳代細胞中都能很好的增殖，并產生明顯的細胞病變和核內嗜酸性包涵體。

疫苗接種是預防、控制甚至消滅豬偽狂犬病主要的措施之一。國內外已研制出豬偽狂犬病的滅活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失弱毒疫苗已經相對成熟，而病毒載體重組疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗尚處于實驗室研究階段。常規(guī)的弱毒疫苗是通過在雞和牛的細胞上多次傳代而獲得的，如Bartha、Buk、Norden和NIA 24疫苗株，通過分子生物學方法已經證明這些疫苗株的gE基因都有部分或完全缺失。通過gE基因缺失苗可以將免疫豬與感染豬區(qū)分開來, 我國目前廣泛使用的PR弱毒凍干疫苗(Bartha-k61) 是一種gI／gE 雙基因缺失弱毒疫苗，由于該基因缺失而進一步阻斷弱毒株回復毒力的可能性，所以大大提高了這種弱毒苗的安全性。世界上很多國家都用這個毒株做的活疫苗凈化了偽狂犬病，目前國內還有鄂A株（98株）等生產，也是一種活疫苗。

2003 年郭萬柱主持研制的豬偽狂犬病gE-／gI-／TK-／LacZ+基因缺失活疫苗SA215株正式獲得國家新獸藥證書。致細胞病變效應、安全性、免疫原性和接種動物抗體消長規(guī)律等生物學特性測定及田間試驗結果顯示，SA215 株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。陳煥春等也成功研制出PRVgG-、gE-等單基因缺失滅活疫苗和TK-／gG-、TK-／gE-等雙基因缺失弱毒疫苗。并建立了相應的區(qū)分野毒感染和疫苗免疫動物的鑒別診斷方法，為我國實施豬偽狂犬病根除計劃提供了相應的技術和產品。

偽狂犬病毒的防控主要是疫苗免疫，而疫苗免疫動物與感染動物體內都會產生蛋白抗體，因此檢測蛋白抗體的診斷方法能確定動物對病毒株的抵抗力。同時日常監(jiān)測疫苗產生抗體是對群體的日常監(jiān)測選擇疫苗、評估免疫程序合理性、掌握豬群健康狀態(tài)的重要手段，同時也可從側面反映管理是否合理，也是適時注射疫苗的主要依據。

市場上大量使用檢測偽狂犬病毒抗體酶標試劑盒，ELISA試劑盒需要酶標儀、溫育反應條件、洗板條件，操作工作環(huán)境和專業(yè)技術人員，另外檢測樣本還需要復雜的前處理，如采集血液，分離血清等；而快速膠體金雖然檢測方便，不需專業(yè)技術人員和工作環(huán)境，但其檢測的靈敏度低，且只能定性，檢測范圍窄。而本發(fā)明專利的目的就是克服以上兩類試劑盒的各自缺點，通過簡單的操作，現場快速、準確、高靈敏地定量（半定量）分析，實現在養(yǎng)豬現場檢測。

發(fā)明內容