[發明專利]一種箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿的分子鑒定方法

在審

• 申請號: 201711054789.9
• 申請日: 2017-11-01
• 公開（公告）號: CN107619876A
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 龐曉慧;郭夢月;任莉;宋經元;陳士林
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿的分子鑒定方法。

背景技術

淫羊藿屬Epimedium L.植物為多年生草本，是古老原始的雙子葉植物類群，在植物系統進化樹中處于特殊分類地位，也是我國傳統的重要藥用植物之一，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的作用，且在助孕、抗骨質疏松、提高免疫力和抑制腫瘤等方面具有明顯功效。《中國藥典》2015年版收錄了5種淫羊藿：淫羊藿E.breviconu Maxim.、箭葉淫羊藿E.sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿E.pubescens Maxim.、朝鮮淫羊藿E.koreanum Nakai和巫山淫羊藿E.wushanense T.S.Ying。淫羊藿屬植物形態極其相似，大大增加了形態學鑒定的難度。箭葉淫羊藿及其近緣物種天平山淫羊藿E.myrianthum Stearn的分類問題一直廣受爭議，僅僅憑借物種形態上的微小差異來對其進行鑒別易導致鑒別不準確等問題的產生。藥材的基原準確是臨床準確用藥的前提，因此需要一種能對箭葉淫羊藿及其近緣物種天平山淫羊藿快速準確鑒定的方法。

DNA條形碼技術根據物種DNA的差異來完成對物種的鑒定，擺脫了傳統形態鑒定方法依賴長期經驗的束縛，不受個體形態、大小等特征和完整性的影響及經驗的限制，能直接從基因水平上提供豐富的鑒別依據，操作步驟簡便，具有穩定、高效、準確等優點，是傳統鑒定方法的有效補充。本發明使用DNA條形碼技術，能夠實現對箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿進行快速準確鑒定。

發明內容

本發明的目的在于提供利用葉綠體psbA-trnH片段鑒別箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿的方法。

具體包括以下步驟：取箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿新鮮葉片，在基因組DNA提取前，用75％的乙醇擦拭表面。

本發明提供的箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿的鑒定方法，包括PCR擴增葉綠體psbA-trnH序列。具體包括如下步驟：

1)提取待測樣品DNA；

2)PCR擴增含有葉綠體psbA-trnH序列的片段；

3)對擴增產物進行雙向測序，拼接，去除引物，獲得完整葉綠體psbA-trnH序列。

本發明所用擴增引物序列為：

正向引物PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；

反向引物TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。

所述PCR擴增的體系為每25μL：

2×Taq PCR Mix 12.5μL，2.5μmol/L引物各1μL，DNA模板2μL(約30ng)，ddH₂O 8.5μL。

所述PCR擴增的條件為94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環。

4)基于K2P模型，構建測序拼接后的psbA-trnH序列的系統發育樹。

與傳統的形態學鑒定、理化鑒定等方法相比，本發明操作簡單，結果準確，所獲得的psbA-trnH序列有助于實現箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿的快速鑒定，縮短鑒定時間。

附圖說明

圖1所示為箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿的種間變異位點圖；

圖2所示為基于psbA-trnH序列構建的箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿的鄰接(NJ)樹。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1

1.從安徽省和湖北省收集箭葉淫羊藿原植物3份；從貴州省不同地區收集天平山淫羊藿原植物4份。詳細信息見表1：

表1 箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿樣品信息表