[發(fā)明專利]改善質譜檢測糖基結晶的方法及產品

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• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107884467A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設計）人: 馬慶偉;梁飛;黃亞娟;丁歡;付書輝;梁坤
• 申請（專利權）人: 北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;H01J49/40
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技術領域

本發(fā)明涉及一種通過改善生物樣本結晶及校正方式來提高MALDI-TOF質譜檢測正確率的方法，能質譜檢測糖基，屬于質譜檢測技術領域。

背景技術

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術已成為目前蛋白質組學研究中的經典技術。在該技術的成功應用過程中,合適的樣品前處理方法起著首要和關鍵的作用。只有將合適的樣品前處理方法與合適的有機基質結合起來,才能成功實現對核酸和蛋白質等生物大分子的準確鑒定。對于基質、溶劑、鹽(金屬離子)和樣品制備方法的選擇是MALDI分析高聚物成敗的關鍵因素。最優(yōu)化的條件是使樣品分子和基質均勻地形成共結晶。MALDI方法分析大分子,重要的關鍵之一是選擇合適的基質。結果表明,效果較佳的基質只有幾種。水溶性合成高分子如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇經常出現于早期的MALDI研究中,這是因為分析多肽的基質也可以應用于它們,對于另外一些高分子,可以從高分子和基質的溶解性中找到一些選擇基質的思路。一般來說,選擇基質時應使基質與高分子的極性比較一致,彼此之間具有兼容性。

微陣列芯片以高密度陣列為特征。微陣列技術就是利用分子雜交原理,使同時被比較的標本與微陣列雜交，通過檢測雜交信號強度及數據處理，把他們轉化成不同標本中特異基因的豐度，從而全面比較不同標本的基因表達水平的差異。微陣列芯片因其高度均一性，結構穩(wěn)定性，樣品用量少及高通量而成為芯片領域中發(fā)展最迅速的一部分。微陣列不僅僅在生物遺傳領域有著廣泛的用途，在其他定量和相對定量分析方面也有著潛在的用途。

微陣列芯片因其微孔尺寸相同，微孔與周圍親疏水性質的差別，較好的限制了樣品所處的范圍，使得所分析的區(qū)域保持一致，使定量分析成為可能。質譜成圖因為其無需標記，無需分離，通過對圖像的分析來進行混合物中組成物質的定量分析，使多組分的同時檢測成為可能，因此利用微陣列芯片中質譜成圖進行多組分的同時定量分析，是一種具有廣泛應用前景的定量分析技術。微陣列芯片中質譜成圖在定量分析中的應用很大程度上取決于樣本結晶的均一性，由于質譜數據采集中的質量歧視，質譜圖的峰高或峰面積無法作為樣品的定量分析的依據，因此如何獲得可靠的，穩(wěn)定的定量數據就顯得尤為重要。

在應用MALDI-TOF MS時，通常將生物樣本與一種飽和的低分子量無機化合物溶液(稱為基質)進行混合加在靶板上，待干后樣本與基質共結晶后形成了以基質包裹構架的樣本固體沉淀。樣本基質結晶體經激光輻射，基質從激光中吸收能量，能量蓄積并迅速產熱，從而使基質晶體升華，使樣品吸附，基質與樣品之間發(fā)生電荷轉移使得樣品分子電離，離子在加速電場下獲得相同的動能，經高壓加速、聚焦后進入飛行時間檢測器。根據離子飛行時間的不同進行分析得出離子質荷比(m/z)和離子峰值，形成質量圖譜，檢測準確性高。通過軟件分析比較,篩選并確定出特異性指紋圖譜,從而實現對目標微生物種或菌株的區(qū)分和鑒定。MALDI-TOF MS可用于分析多種類型的樣本,包括有機分子溶液、核酸、蛋白質以及整個微生物,其中基因、蛋白質和微生物是目前在臨床質譜檢測實驗室應用最廣的項目。

基質輔助激光解吸電離質譜(MALDI-TOF MS)離子源可電離相對分子質量為100～1000 000的生物分子，通過高壓電與短激光脈沖作用，讓基質晶體升化，使基質與樣本分子氣化進入質譜儀的氣相，其最突出的特點是準分子離子化很強、對樣本中雜質的耐受量大，直接分析核酸、蛋白質經電離產生的混合物，能為臨床檢驗中標準物質的研究提供有效的技術保障，是臨床檢驗的參考方法的首選。因此芯片上的樣本結晶形態(tài)和質量好壞直接影響質譜的檢定結果。

在提高芯片的樣本結晶形態(tài)和質量的研究中，現有的研究重點在于如何改進芯片的質量。例如，中國授權專利201410090967.3、“制備親疏水相間的微陣列芯片及其用于質譜成像定量分析的方法”提供了一種通過在芯片上設置疏水和親水區(qū)域來制備檢測芯片，其中采用絲網印刷技術將疏水性聚合物(聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯)按照設計好的模板刷在導電玻璃上，其中涂布區(qū)為疏水區(qū)，空白區(qū)作為預留的親水區(qū)。然后，用親水材料(如樣品體系的水溶液)涂布空白區(qū)，形成均一間隔的親水區(qū)和疏水區(qū)。該方法通過利用絲網印刷技術來設計模板形狀，預先在親水區(qū)留出空白區(qū)(又稱“留白處理”)，因此需要特殊的印刷設備和操作軟件，同時在涂布疏水區(qū)時靶板要絕對靜置。同時，絲網印刷技術的精度低，親疏水區(qū)域的分界不能達到微米精度。并且，需要將待測混合物體系水溶液均勻地鋪在親水區(qū)，芯片烘干固化，置于烘箱中60攝氏度固化2h，增加了生產時間和成本。