[發(fā)明專利]改善質(zhì)譜檢測(cè)蛋白結(jié)晶的方法及產(chǎn)品

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711053576.4
• 申請(qǐng)日: 2017-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN107941894A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬慶偉;梁飛;曲海霞;肖月蘭;付書輝;梁坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N27/62
• 分類號(hào): G01N27/62
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過改善生物樣本結(jié)晶及校正方式來提高M(jìn)ALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)正確 率的方法，能通過質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)分子，屬于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研 究中的經(jīng)典技術(shù)。在該技術(shù)的成功應(yīng)用過程中,合適的樣品前處理方法起著首要和關(guān)鍵的作 用。只有將合適的樣品前處理方法與合適的有機(jī)基質(zhì)結(jié)合起來,才能成功實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸和蛋白 質(zhì)等生物大分子的準(zhǔn)確鑒定。對(duì)于基質(zhì)、溶劑、鹽(金屬離子)和樣品制備方法的選擇是 MALDI分析高聚物成敗的關(guān)鍵因素。最優(yōu)化的條件是使樣品分子和基質(zhì)均勻地形成共結(jié)晶。 MALDI方法分析大分子,重要的關(guān)鍵之一是選擇合適的基質(zhì)。結(jié)果表明,效果較佳的基質(zhì)只 有幾種。水溶性合成高分子如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇經(jīng)常出現(xiàn)于早期的MALDI研究 中,這是因?yàn)榉治龆嚯牡幕|(zhì)也可以應(yīng)用于它們,對(duì)于另外一些高分子,可以從高分子和基 質(zhì)的溶解性中找到一些選擇基質(zhì)的思路。一般來說,選擇基質(zhì)時(shí)應(yīng)使基質(zhì)與高分子的極性比 較一致,彼此之間具有兼容性。

微陣列芯片以高密度陣列為特征。微陣列技術(shù)就是利用分子雜交原理,使同時(shí)被比較的 標(biāo)本與微陣列雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度及數(shù)據(jù)處理，把他們轉(zhuǎn)化成不同標(biāo)本中特異基因 的豐度，從而全面比較不同標(biāo)本的基因表達(dá)水平的差異。微陣列芯片因其高度均一性，結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定性，樣品用量少及高通量而成為芯片領(lǐng)域中發(fā)展最迅速的一部分。微陣列不僅僅在生物 遺傳領(lǐng)域有著廣泛的用途，在其他定量和相對(duì)定量分析方面也有著潛在的用途。

微陣列芯片因其微孔尺寸相同，微孔與周圍親疏水性質(zhì)的差別，較好的限制了樣品所 處的范圍，使得所分析的區(qū)域保持一致，使定量分析成為可能。質(zhì)譜成圖因?yàn)槠錈o需標(biāo)記， 無需分離，通過對(duì)圖像的分析來進(jìn)行混合物中組成物質(zhì)的定量分析，使多組分的同時(shí)檢測(cè)成 為可能，因此利用微陣列芯片中質(zhì)譜成圖進(jìn)行多組分的同時(shí)定量分析，是一種具有廣泛應(yīng)用 前景的定量分析技術(shù)。微陣列芯片中質(zhì)譜成圖在定量分析中的應(yīng)用很大程度上取決于樣本結(jié) 晶的均一性，由于質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集中的質(zhì)量歧視，質(zhì)譜圖的峰高或峰面積無法作為樣品的定量 分析的依據(jù)，因此如何獲得可靠的，穩(wěn)定的定量數(shù)據(jù)就顯得尤為重要。

在應(yīng)用MALDI-TOF MS時(shí)，通常將生物樣本與一種飽和的低分子量無機(jī)化合物溶液 (稱為基質(zhì))進(jìn)行混合加在靶板上，待干后樣本與基質(zhì)共結(jié)晶后形成了以基質(zhì)包裹構(gòu)架的樣 本固體沉淀。樣本基質(zhì)結(jié)晶體經(jīng)激光輻射，基質(zhì)從激光中吸收能量，能量蓄積并迅速產(chǎn)熱， 從而使基質(zhì)晶體升華，使樣品吸附，基質(zhì)與樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，離子 在加速電場(chǎng)下獲得相同的動(dòng)能，經(jīng)高壓加速、聚焦后進(jìn)入飛行時(shí)間檢測(cè)器。根據(jù)離子飛行時(shí) 間的不同進(jìn)行分析得出離子質(zhì)荷比(m/z)和離子峰值，形成質(zhì)量圖譜，檢測(cè)準(zhǔn)確性高。通 過軟件分析比較,篩選并確定出特異性指紋圖譜,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)微生物種或菌株的區(qū)分和 鑒定。MALDI-TOF MS可用于分析多種類型的樣本,包括有機(jī)分子溶液、核酸、蛋白質(zhì),其 中基因、蛋白質(zhì)的檢測(cè)是目前在臨床質(zhì)譜檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣的項(xiàng)目。

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)離子源可電離相對(duì)分子質(zhì)量為 100～1000 000的生物分子，通過高壓電與短激光脈沖作用，讓基質(zhì)晶體升化，使基質(zhì)與樣本 分子氣化進(jìn)入質(zhì)譜儀的氣相，其最突出的特點(diǎn)是準(zhǔn)分子離子化很強(qiáng)、對(duì)樣本中雜質(zhì)的耐受量 大，直接分析核酸、蛋白質(zhì)經(jīng)電離產(chǎn)生的混合物，能為臨床檢驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究提供有效 的技術(shù)保障，是臨床檢驗(yàn)的參考方法的首選。因此芯片上的樣本結(jié)晶形態(tài)和質(zhì)量好壞直接影 響質(zhì)譜的檢定結(jié)果。

在提高芯片的樣本結(jié)晶形態(tài)和質(zhì)量的研究中，現(xiàn)有的研究重點(diǎn)在于如何改進(jìn)芯片的質(zhì) 量。例如，中國(guó)授權(quán)專利201410090967.3、“制備親疏水相間的微陣列芯片及其用于質(zhì)譜成 像定量分析的方法”提供了一種通過在芯片上設(shè)置疏水和親水區(qū)域來制備檢測(cè)芯片，其中采 用絲網(wǎng)印刷技術(shù)將疏水性聚合物(聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯)按照設(shè)計(jì)好的模板 刷在導(dǎo)電玻璃上，其中涂布區(qū)為疏水區(qū)，空白區(qū)作為預(yù)留的親水區(qū)。然后，用親水材料(如 樣品體系的水溶液)涂布空白區(qū)，形成均一間隔的親水區(qū)和疏水區(qū)。該方法通過利用絲網(wǎng)印 刷技術(shù)來設(shè)計(jì)模板形狀，預(yù)先在親水區(qū)留出空白區(qū)(又稱“留白處理”)，因此需要特殊的印 刷設(shè)備和操作軟件，同時(shí)在涂布疏水區(qū)時(shí)靶板要絕對(duì)靜置。同時(shí)，絲網(wǎng)印刷技術(shù)的精度低， 親疏水區(qū)域的分界不能達(dá)到微米精度。并且，需要將待測(cè)混合物體系水溶液均勻地鋪在親水 區(qū)，芯片烘干固化，置于烘箱中60攝氏度固化2h，增加了生產(chǎn)時(shí)間和成本。