[發(fā)明專利]一種透明質(zhì)酸的生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711052093.2
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107586810A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃明良;王鐸學(xué);吳暉暉;楊廷敏;徐大勇;蒲小平
• 申請（專利權(quán)）人: 成都遠(yuǎn)泓生物科技有限公司
• 主分類號: C12P19/26
• 分類號: C12P19/26
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司51214
• 代理人: 吳彥峰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其是一種透明質(zhì)酸的生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝。

背景技術(shù)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)又名玻璃酸，具有高度的保水、潤膚及抗菌入侵的保護(hù)作用而廣泛用作化妝品的添加劑。HA作為一種生化藥物，主要用于治療關(guān)節(jié)炎、眼科粘性手術(shù)、軟組織修復(fù)以及外科手術(shù)后的粘性抑制劑等。HA 是由D-葡糖醛酸和乙酰氨基-D-葡萄糖按1:1的摩爾比組成的酸性粘多糖。在細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)壁，在HA合成酶作用下，HA由尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖(UDP-GlcNAc) 和尿苷二磷酸-葡糖醛酸(UDP-GlcA)兩前提物合成。HA無種屬差異性，無論何種來源，其結(jié)構(gòu)和組成都是一樣的，僅存在相對分子質(zhì)量的差別。

當(dāng)前，HA的生產(chǎn)仍然主要是動物組織提取法和微生物發(fā)酵法。動物組織提取法的原料受限、產(chǎn)量低、分離純化過程復(fù)雜(含硫酸軟骨素、硫酸葡胺聚糖等多糖雜質(zhì))，生產(chǎn)成本高，所獲得的HA分子量也較小，不能滿足市場需求。而微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)規(guī)模不受動物原料限制，發(fā)酵液中HA以游離狀態(tài)存在，易于分離純化，成本低，易于形成規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，無動物來源的致病病毒污染的危險等優(yōu)點。但是，由于細(xì)菌自身代謝與產(chǎn)物表達(dá)之間的不平衡，嚴(yán)重制約了透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。于是，改進(jìn)細(xì)菌發(fā)酵的工藝條件，以提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量具有廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對上述存在的問題，提供一種透明質(zhì)酸的生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝，該生產(chǎn)工藝通過改進(jìn)發(fā)酵過程營養(yǎng)物質(zhì)的成分、添加方式以及發(fā)酵過程的溫度等條件，以尋求發(fā)酵過程中微生物自身生長與產(chǎn)物表達(dá)之間的平衡，從而提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種透明質(zhì)酸的生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其包括：

菌種活化：將菌種接種于斜面菌種培養(yǎng)基上活化得到活化菌種；

種子液制備：將活化菌種接種于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)得到種子液；

擴(kuò)大培養(yǎng)：將種子液接種于擴(kuò)大培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)得到擴(kuò)大培養(yǎng)液；

發(fā)酵培養(yǎng)：將擴(kuò)大培養(yǎng)液接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)分為發(fā)酵前期和發(fā)酵后期；發(fā)酵前期持續(xù)4-6h，溫度為35-37℃，發(fā)酵后期持續(xù)16-24h，溫度為28-32℃；發(fā)酵培養(yǎng)過程中，保持pH 7.0-7.5。

由于采用了上述技術(shù)方案，一方面將菌液的擴(kuò)大培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)相對獨(dú)立，另一方面將發(fā)酵培養(yǎng)分為發(fā)酵前期和發(fā)酵后期，發(fā)酵前期溫度較高，適合于菌體的快速增值，發(fā)酵后期溫度較低，適合于透明質(zhì)酸的累積，以此實現(xiàn)菌體自身代謝與產(chǎn)物表達(dá)之間的平衡，從而提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。

本發(fā)明中采用的菌種為獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus) AWA008，由中國專利CN104059865A公開。

本發(fā)明較佳的實施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及含量分別為:葡萄糖35-40g/L，蔗糖5-10g/L，酵母粉10-12g/L，尿素5-8g/L，蛋白胨5-8g/L，K₂HPO₄ 2.0-2.4g/L， MgSO₄·7H₂O 0.5-1.0g/L。

由于采用了上述技術(shù)方案，發(fā)酵過程中采用復(fù)合碳源以及復(fù)合氮源，能有效提高菌體表達(dá)透明質(zhì)酸的能力。

本發(fā)明較佳的實施例中，種子培養(yǎng)基和擴(kuò)大培養(yǎng)基的成分及含量與發(fā)酵培養(yǎng)基一致。

由于采用了上述技術(shù)方案，在種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)階段，菌種適應(yīng)了發(fā)酵培養(yǎng)基所提供的營養(yǎng)環(huán)境，相當(dāng)于進(jìn)行了一個馴化過程，當(dāng)其進(jìn)入發(fā)酵階段，就能直接利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)進(jìn)行自身代謝或產(chǎn)物表達(dá)。

本發(fā)明較佳的實施例中，從進(jìn)入發(fā)酵后期開始，每隔4-6h添加一次發(fā)酵培養(yǎng)基，共添加四次；四次添加的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積之比依次為1：2：4：8，且添加總體積等于原始的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積。

由于采用了上述技術(shù)方案，即采用了類指數(shù)的補(bǔ)料方式進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過程中，隨著透明質(zhì)酸的累積，發(fā)酵液的粘度不斷增大，從而限制發(fā)酵過程。通過補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)基能緩解透明質(zhì)酸的反饋抑制以及葡萄糖的分解阻遏效應(yīng)。并且，類指數(shù)的補(bǔ)料方式復(fù)合菌體自身的生長代謝規(guī)律，從而能有效促進(jìn)菌體的代謝和透明質(zhì)酸的累積。

本發(fā)明較佳的實施例中，所述發(fā)酵后期，向發(fā)酵液基中加入吐溫80溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％稀堿中的溶液，至吐溫80在發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.04-0.06％。