[發明專利]同時檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的核酸、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201711051039.6
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107604091B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 李偉;張翠萍
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京易捷勝知識產權代理事務所(普通合伙) 11613
• 代理人: 齊勝杰

本發明涉及一組用于同時檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的三種病原的核酸、試劑盒和檢測方法，其中，用于多重PCR同時檢測三種病原的核酸包括腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的上、下游引物；用于熒光定量PCR同時檢測三種病原的核酸還包括有各病原對應的探針。本發明還建立了一種比較高效、靈敏的，可同時檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌這三種病原的檢測方法。該方法能有效提高檢測的靈敏度，避免假陰性結果的發生，為能有效預防黃化病、潰瘍病和葉斑病提供一種技術手段。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術，具體涉及一種用于同時檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的核酸、試劑盒及方法。

背景技術

腐爛病亦稱腐朽病(decay)，又稱爛皮病、臭皮病等，是果木極易產生的一種常見病，世界各地均有發生。腐爛病主要危害結果樹的枝干，發病前期難以察覺，所以需要做好防治措施。發病初期從外表不易識別，如果掀開枝干的表皮，可見到暗褐色致紅褐色濕潤的小斑或黃褐色的干斑，有時，內部病變面積已較大了，而從外部仍不好識別。受害較重時皮層腐爛壞死，用手指按下即下陷。病皮極易剝離，爛皮層紅褐色，濕腐狀時有酒糟味。發病后期，病部失水干縮，變黑褐色下陷，并在上產生黑褐色小點粒，即病菌的分生孢子器，成為再發病的傳染源。除侵染枝干外，有時也侵染果實。果實上病斑癥狀為暗紅色的圓形或不規則形，有輪紋，邊緣清晰。發病部位腐爛軟化，略帶酒糟味，病果表皮易剝離。

叢簇病期葉片生長緩慢，有時只能長到正常的葉片的1/3大，葉片皺縮并散布有褪綠斑，隨著植株生長，頂端葉片呈現叢簇狀，并向下卷曲，有的葉片逐漸黃化，呈淺綠色或淺黃色，產生條斑或斑駁狀。莖節間縮短，呈簇生狀。

黃化病是黃化植原體引起的病害，由過去的零星發病逐漸蔓延開來，感病初期被害葉輕度失綠變黃，但葉脈保持正常綠色，且一般由個別葉片失綠變黃，逐步蔓延到整個樹冠，感病后期葉片變薄，枯萎縮小，枝條干枯，受害樹逐漸枯死，造成了巨大的經濟損失。植原體的檢測方法有組織化學技術檢測法和血清學方法，組織化學技術檢測法是充分利用光學顯微鏡檢查植物和介體昆蟲體內植原體存在的有效手段，不是對植原體特異染色，只是對植原體的間接檢測，容易造成假陽性。該方法與電子顯微鏡觀察一樣，在檢測中都是結合癥狀特征，寄主范圍以及抗生素實驗進行的，費時費力，靈敏度低，而且只能證明待檢植株是否感染植原體，無法區分不同的植原體，這些缺點限制了該類方法的應用，已經越來越不能滿足現代生產的需要。

血清學方法是利用抗原抗體反應對植原體進行檢測，已建立的診斷技術有瓊脂雙擴散、酶聯免疫吸附法(ELISA)、斑點酶聯免疫法 (Dot-ELISA)、免疫熒光染色及免疫電鏡技術等。雖然血清學分析技術比電鏡檢測技術更具特異性和靈敏性，但多數多克隆抗體卻與健康植物寄主抗原存在強烈的交叉反應，導致檢測結果不準確。

蘋果是世界上最重要的商品水果之一，我國是蘋果的主產國，蘋果產業在我國農村社會與經濟中具有重要的地位和作用。近年來，蘋果黃化病、腐爛病和叢簇病在我國蘋果產區的發病率不斷上升，三者復合侵染的情況越來越多，每年給我國蘋果產業造成逾百億元的經濟損失。目前尚缺乏蘋果黃化病、腐爛病和叢簇病的高效殺菌劑和抗病品種，一旦發現有感染這四種病害，需要及時清除病樹，防止病害蔓延此外，還要加強非疫區的管理，防止這幾種病害的侵入，因此，針對導致蘋果腐爛病、黃化病和叢簇病的病原菌進行檢測，建立早期快速同時檢測的方法就顯得尤為重要。

發明內容

(一)要解決的技術問題

為了解決上述技術問題，本發明提供一種用于多重PCR同時檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的核酸，還提供了采用多重實時熒光定量PCR檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的核酸、試劑盒及其檢測方法。

(二)技術方案

為了達到上述目的，本發明采用的主要技術方案包括：