[發明專利]同時檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的核酸、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201711051039.6
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107604091B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 李偉;張翠萍
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京易捷勝知識產權代理事務所(普通合伙) 11613
• 代理人: 齊勝杰

1.一組用于多重PCR同時檢測三種病原的核酸，其特征在于，包括用于檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的上、下游引物，其中，所述腐爛病菌的上游引物序列如SEQ IDNo.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

所述黃化病植原體的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；

所述叢簇病菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。

2.一組用于熒光定量PCR同時檢測三種病原的核酸，其特征在于，包括如權利要求1中所述的用于檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的上、下游引物及各病原體對應的探針，

所述腐爛病菌的探針序列如SEQ ID No.3所示；

所述黃化病植原體的探針序列如SEQ ID No.6所示；

所述叢簇病菌的探針序列如SEQ ID No.9所示。

3.如權利要求1或2所述的核酸，其特征在于，該組核酸還包括檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的陽性擴增產物，其中，

所述檢測腐爛病菌的陽性擴增產物如SEQ ID No.10中第21-197bp所示的序列；

所述檢測黃化病植原體的陽性擴增產物如SEQ ID No.11中第17-106bp所示的序列；

所述檢測叢簇病菌的陽性擴增產物如SEQ ID No.12中第20-219bp所示的序列。

4.一種用于熒光定量PCR同時檢測三種病原的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：如權利要求2中所述的用于檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的三種病原的上、下游引物和相應的探針，各條探針的5'端和3'端分別標記TEXRED-BHQ2、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的三種病原的陽性擴增產物，其中，

所述檢測腐爛病菌的陽性擴增產物如SEQ ID No.10中第21-197bp所示的序列；

所述檢測黃化病植原體的陽性擴增產物如SEQ ID No.11中第17-106bp所示的序列；

所述檢測叢簇病菌的陽性擴增產物如SEQ ID No.12中第20-219bp所示的序列。

6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括Premix EX Taq×2。

7.一種用于熒光定量PCR同時檢測三種病原的檢測方法，其特征在于，該方法用于檢測腐爛病菌、黃化病植原體和叢簇病菌的三種病原，具體包括以下步驟：

(1)從樣品中提取DNA；

(2)對提取的所述DNA進行熒光定量PCR擴增；其中，熒光定量PCR擴增時，在反應體系中，采用所述腐爛病菌的上、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，其探針5'端和3'端分別對應標記TEXRED和BHQ2；所述黃化病植原體的上、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，其探針5'端和3'端分別對應標記FAM和TAMRA；所述叢簇病菌的上、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，其探針5'端和3'端分別對應標記CY5和BHQ3；

(3)收集熒光信號，選擇步驟(2)中的熒光基團的熒光檢測模式，基線調整取3～15個循環的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；

(4)結果判定：待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈現良好的對數增長，則判斷為陽性，如無典型的擴增曲線，判斷為陰性。