[發明專利]一種鑒別煙草鎘轉運基因NtHMA4野生型和突變體的分子標記與應用

在審

• 申請號: 201711048490.2
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107557447A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 高玉龍;李文正;王丙武;宋中邦;李梅云;焦芳嬋;吳玉萍;李永平;徐向麗
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業)53116
• 代理人: 姜開俠,謝喬良

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種鑒別煙草鎘轉運基因NtHMA4野生型和突變體的分子標記與應用。

背景技術

鎘( Cd)、砷( As) 、鉻( Cr) 和汞( Hg) 等是公認的對植物和人體危害比較大的重金屬元素，其中鎘對人體的傷害最大。煙草（Nicotiana tabacum）是重要的經濟作物，是茄科一年生草本植物，而且煙草是富鎘作物，其對鎘的富集系數達到10，所以近年來關于降低煙草中的鎘含量也逐漸成為煙草減害研究的一個熱點。

鎘對人體的危害巨大，過量的鎘進入人體內可能對血管造成損害；另外鎘元素對腸道吸收鐵具有抑制作用，還會干擾鈷、銅、鋅等微量元素的代謝過程，引起肺、腎、肝等人體臟器損害，最終可能導致致癌、致畸和致突變等作用。

擬南芥中AtHMA2、AtHMA4主要負責鋅和鎘從根部向地上部的轉運。過量表達HMA4基因可提高植株對鎘的忍耐力及吸收力，而HMA4基因突變后則能增強植物對鎘的敏感性。RNAi干涉NtHMA4基因的表達后可以降低地上部鎘的鎘含量（Hermand等，2014，Metallomics，6（8）：1427-1440）。為了降低煙草鎘含量，利用EMS誘導我國大面積種植煙草品種云煙87，并從中篩選到一個NtHMA4基因突變體，命名為hma4-4h12。鎘其鎘含量可以降低到野生型的40%左右。突變體hma4-4h12可以應用于煙草育種培育低鎘含量的煙草品種。開發一種簡單、方便、有效的區分突變體與野生型品種的分子標記，以實現對突變型的精準鑒定，對后續利用突變位點進行育種篩選具有重要價值。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種鑒別煙草鎘轉運基因NtHMA4野生型和突變體的分子標記；第二目的在于提供所述的鑒別煙草鎘轉運基因NtHMA4野生型和突變體的分子標記的應用。

本發明的第一目的是這樣實現的，與NtHMA4野生型位點檢測相關的標記，其核苷酸序列如Seq No.1所示；與NtHMA4突變體位點檢測相關的標記，其核苷酸序列如Seq No.2所示。

本發的第二目的是這樣實現的，所述的鑒別煙草鎘轉運基因NtHMA4野生型和突變體的分子標記在利用突變體利用突變體hma4-4h12改良煙草低鎘特性回交轉育過程中的應用。

本發明與現有的技術具有如下優點和效果：

（1）開發了一種用于區分煙草鎘轉運基因NtHMA4突變體與野生型的分子標記，包括1對PCR擴增引物（HMA4-F5/ HMA4-R5）和1個限制性內切酶AIwNI。

（2）本發明的功能性標記通過常規PCR擴增和酶切反應，能夠特異性地檢測NtHMA4基因突變后的低鎘突變體hma4-4h12，而不需要通過測序檢測突變等位基因。本標記更加簡單、快捷。該標記可以應用于利低鎘突變體hma4-4h12培育低鎘煙草材料的過程中，尤其是回交改良低鎘特性時，每個回交世代都要選擇雜合基因型，該標記可以準確選擇目標基因型（雜合型）與輪回親本回交。

附圖說明

圖1為煙草鎘轉運基因NtHMA4野生型序列與突變體hma4-4h12序列比對結果；

圖2為PCR引物HMA4-F5/ HMA4-R5擴增產物電泳圖，其中：M為100bp DNA Ladder，1-4：突變位點為突變純合材料， 5-9：突變位點為雜合材料， 10-15：突變位點為野生型純合材料；

圖3為 PCR產物經AIwNI酶切后電泳圖，其中M：100bp DNA Ladder，1-4：突變位點為突變純合材料， 5-9：突變位點為雜合材料， 10-15：突變位點為野生型純合材料；

圖4為樣品測序結果，方框所示為突變堿基位點，上為樣品1：突變位點為堿基T，顯示單峰，突變體純合；中為樣品5：突變位點為堿基T和C混合，顯示雙峰，雜合突變；下為樣品10：突變位點為堿基C，顯示單峰，野生型純合。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發明的保護范圍。