[發(fā)明專利]同時檢測導致秋海棠立枯病、斑點病和白粉病病原體的核酸、試劑盒及方法

有效

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• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107557445B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設計）人: 李偉;張翠萍
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京易捷勝知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11613
• 代理人: 齊勝杰

1.一組用于熒光定量PCR同時檢測三種病原體的核酸，其特征在于，包括用于檢測分別導致秋海棠立枯病、斑點病和白粉病的三種病原體的上、下游引物及各病原體對應的探針，其中，所述立枯病病原體的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ IDNo.2所示； 所述斑點病病原體的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQID No.5所示； 所述白粉病病原體的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示所述立枯病病原體的探針序列如SEQ ID No.3所示； 所述斑點病病原體的探針序列如SEQ ID No.6所示； 所述白粉病病原體的探針序列如SEQ ID No.9所示。

2.如權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于，該組核酸還包括包含檢測導致秋海棠立枯病、斑點病和白粉病的三種病原體的陽性擴增產(chǎn)物序列，其中， 所述檢測立枯病病原體的陽性擴增產(chǎn)物序列，包含如SEQ ID No.10中第28-155bp之間所示的序列； 所述檢測斑點病病原體的陽性擴增產(chǎn)物序列，包含如SEQ ID No.11中第14-121bp之間所示的序列； 所述檢測白粉病病原體的陽性擴增產(chǎn)物序列，包含如SEQ ID No.12中第3-82bp之間所示的序列。

3.一種用于熒光定量PCR同時檢測三種病原體的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：如權(quán)利要求1所述的導致秋海棠立枯病、斑點病和白粉病的三種病原體的上、下游引物和相應的探針，各條探針的5'端和3'端分別對應標記TEXRED-BHQ1、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。

4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括檢測導致秋海棠立枯病、斑點病和白粉病的三種病原體的陽性擴增產(chǎn)物，其中， 所述檢測立枯病病原體的陽性擴增產(chǎn)物，含如SEQ ID No.10中第28-155bp之間所示的序列； 所述檢測斑點病病原體的陽性擴增產(chǎn)物，含如SEQ ID No.11中第14-121bp之間所示的序列； 所述檢測白粉病病原體的陽性擴增產(chǎn)物，含如SEQ ID No.12中第3-82bp之間所示的序列。

5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括Premix EX TaqTM×2。

6.一種用于熒光定量PCR同時檢測三種病原體的檢測方法，其特征在于，該方法用于檢測導致秋海棠立枯病、斑點病和白粉病的三種病原體，具體包括以下步驟： (1)從樣品中提取DNA； (2)對提取的所述DNA進行熒光定量PCR擴增；其中，熒光定量PCR擴增時，在反應體系中，采用所述立枯病病原體的上、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示，其探針5'端和3'端分別對應標記TEXRED和BHQ1；所述斑點病病原體的上、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，其探針5'端和3'端分別對應標記FAM和TAMRA；所述白粉病病原體的上、下游引物和探針的核苷酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示，其探針5'端和3'端分別對應標記CY5和BHQ3； (3)收集熒光信號，選擇步驟(2)中的熒光基團的熒光檢測模式，基線調(diào)整取3～15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線； (4)結(jié)果判定：待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈現(xiàn)良好的對數(shù)增長，則判斷為陽性，如無典型的擴增曲線，判斷為陰性。