[發(fā)明專利]一種用于診斷原發(fā)性肝癌的特異性生物標(biāo)志物及其篩選方法與應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN107663541A
• 公開（公告）日: 2018-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 申志發(fā);季敬璋;涂可欣;楊麗虹;童慶超;葉相來;閆相楠
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12N15/113
• 代理公司: 溫州金甌專利事務(wù)所(普通合伙)33237
• 代理人: 黃肇平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于診斷原發(fā)性肝癌的特異性生物標(biāo)志物及其篩選方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝細(xì)胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)的第五種最常見的惡性腫瘤。盡管這些年在HCC的診療上有很大的進(jìn)步，但由于臨床上HCC經(jīng)常會(huì)有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，HCC患者的5年生存率仍然相當(dāng)?shù)汀CC的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)典型的多階段過程：首先是肝臟組織在外界刺激下（B型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染、黃曲霉毒素B1的攝入量或酒精濫用等）發(fā)生慢性肝炎或肝硬化，然后在經(jīng)歷一系列增生和不典型增生階段后，最終獲得肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的惡性表型。

腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞脫離其原發(fā)部位，向其它部位傳播，進(jìn)而浸潤正常組織，并經(jīng)過淋巴道、血管或體腔及其它方式，轉(zhuǎn)運(yùn)到繼發(fā)的靶組織或器官，從而繼續(xù)增殖生長，形成與原發(fā)腫瘤相同性質(zhì)的繼發(fā)腫瘤的過程。細(xì)胞開始形成局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力是惡性肝腫瘤早期特有的性質(zhì)，因此研究肝腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移初期機(jī)制對臨床診療有十分重要的意義。而肝癌的進(jìn)展涉及到很多調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移的關(guān)鍵基因（見圖2）。

近年來在HCC的基礎(chǔ)與臨床研究方面雖然取得了一些進(jìn)展，但始終未能闡明HCC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制。因此，尋找有效的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)抑制途徑，已成為進(jìn)一步提高生存率的關(guān)鍵。研究提示，在人類腫瘤中，microRNA（miRNAs）既可以作為癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，也可以發(fā)揮抑癌基因的功能抑制腫瘤。

尋找腫瘤相關(guān)的miRNAs，并探討其具體作用的機(jī)制或其成為新的分子診斷標(biāo)志物，已成為腫瘤相關(guān)研究中的新方向。miRNAs的異常表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在腫瘤產(chǎn)生、癌細(xì)胞增殖和調(diào)亡、腫瘤的血管發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用。相應(yīng)的研究亦證實(shí)：某些miRNAs在HCC的腫瘤產(chǎn)生、腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡、腫瘤的血管發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在肝癌組織中經(jīng)常表達(dá)失調(diào)，并且一些特定的miRNAs與肝癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后等臨床病理特征相關(guān)。因此，miRNA可能作為HCC新的分子診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的提供了一種用于診斷原發(fā)性肝癌的特異性生物標(biāo)志物及其篩選方法及應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種用于診斷原發(fā)性肝癌的特異性生物標(biāo)志物，所述的特異性生物標(biāo)志物為miRNA hsa-let-7a-5p。

一種用于診斷原發(fā)性肝癌的血清標(biāo)志物hsa-let-7a-5p的篩選方法，包括以下步驟：

(1)建立HCCLM3細(xì)胞模型

(2)從已建成的細(xì)胞模型中分離細(xì)胞突出和細(xì)胞體；

(3)從分離的細(xì)胞突出和細(xì)胞體中分別提取 RNA；

(4)在前期miR-Seq測序結(jié)果內(nèi)篩選本體表達(dá)高且差異倍數(shù)大的候選miRNAs；

(5)收集HCC患者組織、血漿樣本及臨床資料，提取miRNA；

(6)將抽提的 miRNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA；

(7)進(jìn)一步用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析方法對正常人和HCC患者進(jìn)行逐個(gè)驗(yàn)證篩選，并對篩選出具有監(jiān)測肝細(xì)胞性肝癌轉(zhuǎn)移性的特異性生物標(biāo)志物的miRNA并對臨床價(jià)值進(jìn)行評估 。

一種檢測原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌的試劑盒，所述的試劑盒包括有檢測特異性生物標(biāo)志物hsa-let-7a-5p的試劑。

所述的檢測生物標(biāo)志物hsa-let-7a-5p的試劑包含一對特異性引物，引物序列為：

F Primer: CGATTCAGTGAGGTAGTAGGTTGT；

R Primer: TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT。

一種用于診斷原發(fā)性肝癌的血清標(biāo)志物hsa-let-7a-5p在作為肝細(xì)胞性肝癌檢驗(yàn)指標(biāo)上的應(yīng)用。

一種用于診斷原發(fā)性肝癌的血清標(biāo)志物hsa-let-7a-5p聯(lián)用腫瘤生物標(biāo)志物AFP、CEA在作為肝細(xì)胞性肝癌轉(zhuǎn)移性指標(biāo)上應(yīng)用。