[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)單堿基突變的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711045243.7
• 申請(qǐng)日: 2017-10-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107723341B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇昕;郝丹丹;喻長(zhǎng)遠(yuǎn);蔡爽;張怡
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6827
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6827
• 代理公司: 北京聿宏知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;桑勝梅

本發(fā)明涉及基因突變檢測(cè)領(lǐng)域的一種檢測(cè)單堿基突變的方法。該方法其包括以下步驟：S1，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)熒光信號(hào)探針；所述熒光信號(hào)探針與目標(biāo)基因的突變型基因完全互補(bǔ)，與目標(biāo)基因的野生型基因形成單堿基錯(cuò)配；S2，在含熒光信號(hào)探針的溶液中加入目標(biāo)基因的待測(cè)樣本和λ核酸外切酶，形成反應(yīng)體系；S3，獲取反應(yīng)體系在反應(yīng)過(guò)程中的實(shí)時(shí)熒光曲線，判斷目標(biāo)基因的待測(cè)樣本中是否存在單堿基突變。本發(fā)明所述方法可以快速準(zhǔn)確地對(duì)單堿基突變基因序列進(jìn)行檢測(cè)，且對(duì)單堿基突變基因序列具有高度的選擇性，可用于低豐度突變檢測(cè)。另外，所述方法的檢測(cè)成本低廉、易于制備，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性高，易于推廣到非專(zhuān)業(yè)人員操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因突變檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)單堿基突變的方法。

背景技術(shù)

基因測(cè)序技術(shù)表明，人類(lèi)基因組中堿基的變化與腫瘤的形成發(fā)展有著密切的關(guān)系。在分離的大量腫瘤患者組織切片樣品中，發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細(xì)胞的基因組中存在單堿基點(diǎn)突變。但是在腫瘤發(fā)病早期，腫瘤細(xì)胞的含量低，突變基因在腫瘤細(xì)胞中的百分比也相對(duì)較低。

基因突變檢測(cè)技術(shù)可以分為測(cè)序型和非測(cè)序型。測(cè)序型技術(shù)準(zhǔn)確度高，能做重復(fù)序列但是樣品制備成本高，需要的核酸濃度較高且分析時(shí)間長(zhǎng)，不能做低豐度檢測(cè)，難以在臨床樣品中直接檢出低頻突變。非測(cè)序型技術(shù)主要以核酸雜交探針為基礎(chǔ)，其分析目標(biāo)為已知突變基因的確認(rèn)和含量測(cè)定。在動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)的研究領(lǐng)域，一種新型的核酸雜交模式-核酸非穩(wěn)態(tài)雜交近來(lái)受到關(guān)注。這種雜交模式是指雙鏈核酸在其解鏈溫度附近呈現(xiàn)雜交與解鏈的平衡。在這種平衡狀態(tài)下，它可以突破核酸穩(wěn)定雜交的熱力學(xué)瓶頸，對(duì)單堿基變化非常敏感。在室溫條件下，一般雜交的雙鏈長(zhǎng)度為9-12個(gè)堿基。在這種情況下，完全匹配的核酸雙鏈與單堿基錯(cuò)配的核酸雙鏈存在較大的雜交動(dòng)力學(xué)差異，單堿基錯(cuò)配雙鏈的解鏈動(dòng)力學(xué)常數(shù)比完全匹配雙鏈的高20-100倍。

λ核酸外切酶能作用于5’磷酸標(biāo)記的雙鏈DNA，沿5’到3’方向漸進(jìn)性催化去除5’單核苷酸，其最適底物是5’磷酸化的雙鏈DNA。λ核酸外切酶降解雙鏈的速度對(duì)堿基配對(duì)情況敏感，錯(cuò)配的存在通常導(dǎo)致λ核酸外切酶的降解速度下降。

因此，結(jié)合核酸非穩(wěn)態(tài)雜交和λ核酸外切酶，開(kāi)發(fā)出能夠檢測(cè)低豐度單堿基突變的動(dòng)力學(xué)方法，對(duì)于臨床診斷研究和基礎(chǔ)研究都有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種檢測(cè)單堿基突變的方法，該方法可以快速準(zhǔn)確地對(duì)單堿基突變基因序列進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)突變序列具有高度的選擇性，并且能用于低豐度突變的檢測(cè)。

為此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)單堿基突變的方法，其包括以下步驟：

S1，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)熒光信號(hào)探針；所述熒光信號(hào)探針與目標(biāo)基因的突變型基因完全互補(bǔ)，與目標(biāo)基因的野生型基因形成單堿基錯(cuò)配；

S2，在含熒光信號(hào)探針的溶液中加入目標(biāo)基因的待測(cè)樣本和λ核酸外切酶，形成反應(yīng)體系；

S3，獲取反應(yīng)體系在反應(yīng)過(guò)程中的實(shí)時(shí)熒光曲線，判斷目標(biāo)基因的待測(cè)樣本中是否存在單堿基突變。

根據(jù)本發(fā)明，若獲取的實(shí)時(shí)熒光曲線隨時(shí)間變化呈上升趨勢(shì)或隨時(shí)間變化先呈上升趨勢(shì)然后趨于平穩(wěn)，則目標(biāo)基因的待檢樣本中存在單堿基突變；若獲取的實(shí)時(shí)熒光曲線隨時(shí)間變化一直趨于平穩(wěn)，則目標(biāo)基因的待檢樣本中不存在單堿基突變。

根據(jù)本發(fā)明，所述熒光信號(hào)探針上帶有熒光基團(tuán)、熒光淬滅基團(tuán)和5’端磷酸標(biāo)記。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述熒光信號(hào)探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的堿基個(gè)數(shù)為9-12個(gè)；優(yōu)選地，所述熒光信號(hào)探針與目標(biāo)基因互補(bǔ)的堿基個(gè)數(shù)為11-12個(gè)。

在本發(fā)明的另一些實(shí)施方式中，所述熒光信號(hào)探針與目標(biāo)基因的野生型基因形成的單堿基錯(cuò)配位置位于目標(biāo)基因的野生型基因5’端的第4-11位點(diǎn)，優(yōu)選為第4-7位點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)選為第4位點(diǎn)。