[發明專利]一種檢測單堿基突變的方法

有效

• 申請號: 201711045243.7
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107723341B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 蘇昕;郝丹丹;喻長遠;蔡爽;張怡
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;桑勝梅

1.一種非疾病診斷的檢測單堿基突變的方法，其包括以下步驟：

S1，根據目標基因設計熒光信號探針；所述熒光信號探針與目標基因的突變型基因完全互補，與目標基因的野生型基因形成單堿基錯配；

S2，在含熒光信號探針的溶液中加入目標基因的待測樣本和λ核酸外切酶，形成反應體系；

S3，獲取反應體系在反應過程中的實時熒光曲線，判斷目標基因的待測樣本中是否存在單堿基突變；若獲取的實時熒光曲線隨時間變化呈上升趨勢或隨時間變化先呈上升趨勢然后趨于平穩，則目標基因的待檢樣本中存在單堿基突變；若獲取的實時熒光曲線隨時間變化一直趨于平穩，則目標基因的待檢樣本中不存在單堿基突變；

所述熒光信號探針與目標基因的野生型基因形成的單堿基錯配位置位于熒光信號探針5’端的第4位點；所述熒光信號探針與目標基因互補的堿基個數為12個；

所述單堿基突變為堿基G突變為堿基A；

所述步驟S2具體包括：在含熒光信號探針的溶液中加入5μL目標基因的待測樣本，然后加入0.5mol/L的5μL氯化鈉溶液，并用無酶水將體積補充至48μL，最后加入2μL的λ核酸外切酶到管壁上，蓋好蓋子，用離心機渦旋混勻，形成反應體系；

步驟S2中形成的反應體系中，熒光信號探針的濃度為80-100nM；目標基因的待測樣本的濃度與熒光信號探針的濃度之比為1:(1-1.2)；λ核酸外切酶的濃度為20-30nM；

步驟S3中，用酶標儀獲取反應體系在反應過程中的實時熒光曲線，酶標儀程序每8s一個循環監測，總共270個循環；反應過程中的反應溫度為35-40℃，反應時間為10-20min；

所述熒光信號探針上帶有熒光基團、熒光淬滅基團和5’端磷酸標記；

所述熒光信號探針的序列為5’-3’:P-TCT-FAM-CCACAGTCAAA-BHQ1；

所述方法對單堿基突變的檢測限為0.1％。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2中形成的反應體系中，λ核酸外切酶的濃度為25-28nM。