[發明專利]一種N?中端骨鈣素化學發光檢測試劑盒及其制備方法在審

申請號：	201711040541.7	申請日：	2017-10-31
公開（公告）號：	CN107831314A	公開（公告）日：	2018-03-23
發明（設計）人：	胡雪婷;常燕;劉麗青;曹晶;杜愛銘;徐兵	申請（專利權）人：	太原瑞盛生物科技有限公司
主分類號：	G01N33/68	分類號：	G01N33/68;G01N33/543;G01N21/76;G01N33/577
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種中端骨鈣素化學發光檢測試劑盒及其制備方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于免疫檢測分析技術領域，具體是一種N-中端骨鈣素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

骨鈣素是骨基質中最重要的一種特異性非膠原蛋白，由骨和牙齒中的成骨細胞合成并分泌，其與骨鈣的結合作用依賴于維生素K。骨鈣素分子含49個氨基酸，分子量約為5800D。在骨合成中，成骨細胞產生骨鈣素，此過程依賴于維生素K，同時維生素D3有促進產生骨鈣素的作用。使用維生素K拮抗劑，可使此蛋白在骨中的含量減少，但并不影響其脯氨酸的含量，也不影響骨的機械強度。骨鈣素產生后一部分進入骨基質，另一部分釋放進入外周血。因此，血清（血漿）中骨鈣素的含量與各種骨代謝紊亂中骨轉化率有關。

完整的骨鈣素包含49個氨基酸，1-43氨基酸的片段為N-中端骨鈣素（N-MID）。完整的骨鈣素在外周血中不穩定，羧基端的43-44間的氨基酸易被蛋白酶水解，裂解下來的N-MID則穩定的多。因此，測定血清（血漿）中的穩定N-MID，從而確保檢測結果的穩定性。

目前，檢測N-中端骨鈣素的方法有放射免疫技術、膠乳增強比濁法、酶聯免疫技術、化學發光免疫技術等。其中，放射免疫技術，放射免疫測定法雖然具有高靈敏度、高特異性的優點，但其操作步驟較多，需要特殊的檢測設備，試劑價格昂貴，需使用配套的儀器且存在放射性污染，使操作人員受到放射性危害；另外，放射性同位素易衰減，有效期短，不易保存。酶聯免疫方法，采用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記物，其酶標記物易失活，顯色底物見光易分解，靈敏度低，操作復雜、重復性差、不適于急診和臨床病人及時診斷的需要，且其對結構類似的化合物具有一定的交叉反應，造成測試結果不準確。膠乳增強免疫比濁法雖然具有操作簡單、快速的優點，但是靈敏度低、低值重復性差。

CN 106353106 A（2017.01）公開了一種化學發光檢測骨鈣素試劑盒，該試劑盒采用堿性磷酸酶標記骨鈣素單克隆抗體，采用堿性磷酸酶的缺點主要是酶促受環境影響大：如消毒液、酸堿度、離子都會對其造成影響，影響測定結果，且底物達到平臺期的時間長，底物成本高，導致檢測成本高。而本公司開發的一種N-中端骨鈣素化學發光試劑盒，采用吖啶酯作為標記物，具有檢測穩定、測量快速、靈敏度高的優點。

化學發光方法較其他方法的優點在于檢測的簡單性。

該體系采用磁分離體系，吖啶酯標記的化學發光技術進行檢測，其具有的優點是：吖啶酯作為發光劑不需催化劑的存在，在有過氧化氫的稀堿溶液中即能發光；吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗體結合位點，可提高系統整體靈敏度，反應迅速；背景低、信噪比高，是一類有效的化學發光標記物。

發明內容

本發明的目的在于提供一種靈敏度更高、反應時間短、操作簡單、抗干擾性高的N-中端骨鈣素的磁微粒化學發光檢測試劑盒及制備方法。

為實現上述目的，本發明采取如下技術方案：

一種N-中端骨鈣素的磁微粒化學發光檢測試劑盒及制備方法，本發明所提供的磁微粒化學發光方法檢測N-中端骨鈣素的試劑盒，采用磁微粒偶聯N-中端骨鈣素捕獲抗體，吖啶酯標記N-中端骨鈣素檢測抗體。試劑盒還包括N-中端骨鈣素校準品、上述吖啶酯作用的化學發光預激發液A、化學發光激發液B以及清洗液。

本發明所述磁珠的內核為四氧化三鐵或三氧化二鐵，所述磁珠的表面修飾基團為羧基、氨基、對甲苯磺酰基或鏈霉親和素-生物素。

本發明中的磁顆粒偶聯懸浮液由N-中端骨鈣素捕獲抗體偶聯的磁顆粒和試劑緩沖液組成，其中N-中端骨鈣素捕獲抗體的濃度為0.1-2.0 mg/mL。

本發明中的化學發光標記物為吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。

本發明中的吖啶酯標記物是吖啶酯標記N-中端骨鈣素檢測抗體溶液，其中吖啶酯溶液的濃度范圍為2-85 mmol/L。

本發明中與磁顆粒偶聯的N-中端骨鈣素捕獲抗體和吖啶酯標記的N-中端骨鈣素檢測抗體均為單克隆抗體。

本發明中偶聯緩沖液是pH 5.0-6.0，濃度為20-200 mmol/L的MES緩沖液。