[發明專利]一種利用ANP或IgANP基因構建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應用

有效

• 申請號: 201711040353.4
• 申請日: 2017-10-30
• 公開（公告）號: CN107828819B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 張軍林;岳碩豪;趙志揚;謝立蘭;賴曉晶;程燁;李毅
• 申請（專利權）人: 武漢生物工程學院
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/16;C12N7/01;A61K38/22;A61K48/00;A61P35/00;A61P1/02
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發明公開了一種利用ANP或IgANP基因構建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應用。本發明以ANP為目的基因構建重組腺病毒載體，該載體在舌癌細胞SCC9內表達ANP多肽，同時在ANP序列前添加一個免疫球蛋白的信號肽序列，構建分泌型ANP多肽。重組腺病毒感染舌癌細胞，通過RT?PCR，證實了ANP或IgANP可以在舌癌細胞SCC9中表達，通過MTT細胞相對活性檢測和細胞劃痕實驗，證實了ANP在體外實驗中具有抑制舌癌細胞SCC9活性和遷移的作用，并且IgANP的作用效果更為明顯，從而抑制舌癌細胞生長。本發明方法效率高、產量大，提供了一種未見報道的抗腫瘤細胞遷移和生長的基因治療系統。

技術領域

本發明涉及構建重組腺病毒的方法，具體說，是一種利用ANP或IgANP基因構建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和在制備抑制舌癌細胞活性的藥物中的應用。

背景技術

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，98％以上為鱗狀細胞癌，其生物學特性主要表現為局部浸潤生長及頸部淋巴結轉移。舌鱗癌患者頸部淋巴結轉移率較高，易發生早期頸淋巴結轉移，發生頸淋巴結轉移者的預后較未發生頸淋巴結轉移者明顯變差，頸淋巴結轉移是導致舌鱗癌患者死亡的重要因素之一。因此，如何抑制癌細胞轉移，提高治療預后性顯得尤為重要。

在過去幾十年里人們癌癥的研究和治療已經取得了重大進展。然而，傳統的癌癥治療效果不理想，大多數化療藥物對癌細胞有殺傷性但也對健康快速分裂的細胞有殺傷性，并且也會抑制免疫系統，同時也存在著癌癥耐藥性以及瘤區藥物濃度不足等問題。這大大降低了他們的治療效果，其原因與藥物對癌癥細胞特異性不足有關。由于需要不斷尋找新的治療藥物，尤其是那些能夠逃避耐藥性、抑制轉移和無其他重要的副作用的藥物，抗癌肽已成為新的研究的目標之一。抗癌肽是一類小分子多肽類新型抗癌藥物，通過破壞腫瘤細胞膜結構或抑制癌細胞增殖和遷移以及腫瘤血管的形成達到對癌細胞殺傷作用，而對正常細胞的毒性較低，是目前抗腫瘤新藥研究的一大熱點。

心房利鈉肽(ANP)是一種由28個氨基酸殘基組成的多功能活性肽，亦稱心房利鈉因子、心房利尿肽、心鈉素或心房肽。最早從大鼠以及人的心房組織中分離出一種具有利鈉利尿的活性多肽物質——心房利尿肽，在臨床上具有增加血管通透性、降壓、利鈉、利尿、舒張血管平滑肌及抑制細胞增殖等作用，在維持血壓，水、鈉平衡及在心血管疾病的病理生理過程中發揮的重要作用已得也到了廣泛的認可。在最近的研究發現，它可以直接殺死腫瘤細胞或強力抑制癌細胞DNA的合成，從而抑制癌細胞的生長，而對正常的人體細胞不會產生毒性反應。

現有的給藥途徑包括口服給藥、呼吸道給藥、經皮給藥。胃腸道對蛋白質多肽類藥物的低吸收及其中的酶對藥物的降解是口服多肽類藥物面臨的兩大障礙。因此，尋找合適的吸收位點，避免胃腸道的酶降解作用以及肝臟的首過效應是解決問題的關鍵。多肽藥物在呼吸道給藥的同時也面臨著鼻粘膜中氨肽酶對多肽降解的威脅，鼻腔纖毛的清除作用也會影響多肽藥物的吸收。經皮給藥可以避免蛋白酶的直接降解和組織器官的清除作用，但是此方法必須克服皮膚角質層的屏障，為促進多肽藥物進入皮膚，目前應用較多的是離子導入技術，但是該系統大多還處于實驗室階段，仍然存在一些問題，比如：通過皮膚的電流，因皮膚的生理條件而受強度和持續時間的限制；促滲機制的確定；透皮藥物的選擇；導入裝置的更加實用、方便、經濟等都需進一步研究。

本發明根據抑制腫瘤細胞轉移提高癌癥治療預后性的策略提供了一種新的、有臨床應用前景的抑制腫瘤細胞轉移的靶向藥物。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，以ANP或分泌型ANP(IgANP)為目的基因構建重組腺病毒載體，用重組腺病毒載體作為舌癌基因治療的系統，利用表達ANP或分泌型ANP的基因治療方法可以起到抑制舌癌細胞活性和遷移的作用。

為實現本發明的目的，本發明提供以下技術方案：

在第一方面，本發明提供一種利用ANP或分泌型ANP基因重組腺病毒的構建方法，包括以下步驟：

1)proANP基因片段的獲得：