[發明專利]一種利用ANP或IgANP基因構建重組腺病毒的方法及重組腺病毒和應用

有效

• 申請號: 201711040353.4
• 申請日: 2017-10-30
• 公開（公告）號: CN107828819B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 張軍林;岳碩豪;趙志揚;謝立蘭;賴曉晶;程燁;李毅
• 申請（專利權）人: 武漢生物工程學院
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/16;C12N7/01;A61K38/22;A61K48/00;A61P35/00;A61P1/02
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種表達ANP或分泌型ANP的重組腺病毒，其特征在于，其攜帶ANP或分泌型ANP基因，所述ANP 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述分泌型ANP 基因的核苷酸序列如SEQID NO：4所示；

構建所述重組腺病毒所用的穿梭質粒為pAdTrack-CMV；構建所述重組腺病毒所用的病毒骨架質粒為pAdeasy-1；構建所述重組腺病毒所用的包裝細胞為人胚腎293A細胞；

其表達ANP或分泌型ANP，所述ANP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，分泌型ANP的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述表達ANP或分泌型ANP基因重組腺病毒的構建方法，包括以下步驟：

1）proANP基因片段的獲得：

a、細胞總RNA的提取；

b、cDNA的獲得；

c、proANP基因擴增：proANP基因擴增體系所用的引物如下：

Sene：CGGGTACCCCATGAGCTCCTTCTCCACCACC；酶切位點：Kpn I；

Antisene：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；酶切位點：Xba I；

重疊PCR引物1：CTTCCAAATGGTCCAGCAAATTCTTGAAATCCATCAG GTCTGCG；

重疊PCR引物2：CGCAGACCTGATGGATTTCAAGAATTTGCTGGACCAT TTGGAAG；

2）ANP和IgANP基因片段的獲得：

a、利用PCR反應從proANP片段中獲取ANP基因，所用引物如下：

ANP sens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGAGCCTGCGGAGATCCAGC；酶切位點：EcoR I；

ANP anti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；酶切位點：Xba I；

b、重疊PCR反應獲得IgANP基因：

首先，利用PCR反應合成可用于重疊PCR的Igκ信號肽基因，所用引物如下：

Igκ sens序列：CGGAATTCCGGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGG；酶切位點：EcoR I；

Igκ anti序列：GCAGCTGGATCTCCGCAGGCTGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCC；

以及，利用PCR反應從proANP片段中獲取可用于重疊PCR的SecANP基因，所用引物如下：

SecANP sens序列：AGCCTGCGGAGATCCAGC；

ANP anti序列：GCTCTAGAGCTCAGTACCGGAAGCTGTTACAGC；

最后，以上述Igκ信號肽基因和ANP基因為模板，獲得IgANP基因片段，所用引物為SecANP sens和Igκ anti；

3）pMD-20T-IgANP或pMD-20T-ANP載體的構建

IgANP或ANP與pMD-20T載體連接體系： pMD-20T載體、重疊IgANP或ANP分別被 Kpn I、Xba I雙酶切回收產物，連接體系置于16℃恒溫儀過夜；

4）pAdTrack-IgANP或pAdTrack-ANP穿梭載體的構建：IgANP或ANP Kpn I、Xba I雙酶切回收產物與Kpn I、Xba I雙酶切Track載體連接；

5）pAd-IgANP或pAd-ANP 腺病毒骨架載體的構建：pAdTrack-IgANP或pAdTrack-ANP質粒Pme I單酶切，取回收產物與pAd-easy-1質粒一起轉化BJ5183感受態中，提取質粒即pAd-IgANP或pAd-ANP；

6）制備重組腺病毒Ad-IgANP或Ad-ANP：將提取的pAd-IgANP或pAd-ANP質粒，使用Pac I單酶切線性化后，使用Lipofectamine2000轉染293-A細胞，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白報告基因的表達，7天后可看到大量細胞漂浮,熒光開始減弱，此時先吸出一部分上清液轉移到無菌的15mL的離心管中，剩余的培養基反復吹打皿底未漂浮的細胞，將其同培養基一起轉移到離心管中；1000轉，5min，離心收集上清液，即為包裝后獲得的重組腺病毒Ad-IgANP或Ad-ANP。

2.權利要求1所述的重組腺病毒在制備抑制舌癌細胞活性的藥物中的應用。